Tesis doctoral de Marta Gutiérrez Larraínzar
Hoy en día existe una creciente preocupación por la utilización de compuestos naturales en la conservación de alimentos, como es el caso de antioxidantes procedentes de plantas. Así, el mercado de los antioxidantes sintéticos está en declive, mientras que los naturales ganan importancia debido a la aceptación de los consumidores y a los requerimientos legales para acceder al mercado. Diversos estudios han localizado en los compuestos fenólicos el agente conservador de productos, cuya acción, además de ser antioxidante, tiene un efecto negativo sobre el crecimiento de ciertas bacterias patógenas. en nuestro grupo de investigación se ha puesto de manifiesto la presencia de d-eritroascorbato (d-eaa) y un glucósido de éste (d-eaag) en el hongo filamentoso phycomyces blakesleeanus. Puesto que el d-eritroascorbato es un análogo del l-ascorbato (vitamina c) que está presente en hongos, es probable que desempeñe en estos organismos funciones similares al ascorbato. El ácido ascórbico, como un potente antioxidante natural, es utilizado en la industria como aditivo alimentario, evitando así la oxidación de los alimentos; en la industria cosmética y farmaceútica y es utilizado también como bactericida. En este sentido, el ácido d-eritroascórbico podría ser utilizado en lugar del ascorbato en varios procesos industriales. En este contexto, nuestro trabajo se ha centrado en el estudio de dos compuestos análogos de la vitamina c (conocido antioxidante), el d-eaa y el d-eaag, como compuestos antioxidantes y antimicrobianos frente a especies bacterianas presentes en la leche y el queso, así como de otros compuestos que actualmente están siendo utilizados en la industria alimentaria. para los estudios que desarrollamos en este trabajo fue necesario llevar a cabo la purificación del d-eaa y del d-eaag presentes en extractos miceliales utilizando dos columnas de intercambio iónico dispuestas en serie: la primea de intercambio catiónico y la segunda de intercambio aniónico. La cuantificación e identificación de ambos compuestos se realizó mediante hplc. a partir de muestras purificadas de d-eaag determinamos la masa molecular de dicho compuesto mediante espectrometría de masas. El espectro de masas obtenido mostró una intensa señal a un valor de m/z a 307, que está de acuerdo con la fórmula molecular c11o10h16 (m=308), correspondiente a la forma monoglucósido del d-eaa. Las propiedades espectrales y constante de ionización del d-eritroascorbato glucosilado, similares a las del ácido l-ascórbico, son compatibles con la unión del resto glucídico al carbono 5 del d-eritroascorbato. en el estudio de las propiedades físico-químicas también determinamos la estabilidad de la forma glucosilada del d-eaa frente a la oxidación en disolución acuosa bajo condiciones aeróbicas y lo comparamos con los resultados obtenidos para el d-eaa. El d-eritroascorbato es más estable a ph 4 y ph 8 que a ph 6; el d-eaag es mucho más estable con valores ácidos de ph que con valores básicos. Además el d-eaag es más estable que el d-eaa a phs ácidos, sin embargo a ph 8 sucede lo contrario, el d-eaa es más estable que el d-eaag. el d-eaag es sintetizado a partir de d-eritroascorbato por una glucosiltransferasa presente en micelio de p. Blakesleeanus, que requiere udp-glucosa como dador de grupos glucosilo. La máxima actividad glucosiltransferásica se obtiene en la fase estacionaria de crecimiento del hongo en concordancia con los niveles mas elevados de d-eaag. El estudio cinético de la udp-glucosa: d-eaa glucosiltranferasa fue llevado a cabo tanto para el sustrato dador como para el sustrato aceptor, obteniéndose en ambos casos una curva hiperbólica de saturación. Se determinó un valor de km aparente de 2,5 mm y de vmax aparente de 0,11 nmoles d-eaag/min mg proteína para la udp-glucosa; y un valor de km aparente de 41,3µm y de vmax aparente de 0,07 nmoles d-eaag/min mg proteína para el d-eaa. se estudió la producción de d-eaa y su glucósido utilizando distintas fuentes de carbono y de nitrógeno, tanto en luz como en oscuridad. El cultivo del hongo en presencia de d-arabinosa ó d-arabinono-1,4-lactona en luz conduce a la máxima producción de ambos compuestos, con un incremento de 30 veces del d-eaa y de 4 veces del d-eaag respecto al control con glucosa. P. Blakesleeanus excreta al medio de cultivo d-eaa y su forma glucosilada, siendo los niveles de d-eaa superiores a los de d-eaag, lo que sería compatible con un sistema de transporte que presentaría una mayor afinidad por el d-eaa. teniendo en cuenta la analogía en cuanto a las propiedades físico-químicas del d-eaa y d-eaag con el l-aa y que ya, en nuestro grupo de investigación, se había demostrado que ambas moléculas participan en el mecanismos de defensa antioxidante in vivo del hongo, nos propusimos determinar la capacidad antioxidante in vitro tanto del d-eaa como del d-eaag y comparar los resultados con los obtenidos para otros compuestos antioxidantes utilizados en la industria, tanto sintéticos como naturales. La determinación de la capacidad antioxidante se llevó a cabo mediante tres métodos distintos (dpph, frap y abts), ya que todos ellos muestran una distinta sensibilidad y además no existe un método único en la determinación de la capacidad antioxidante. Tanto el d-eaa como el d-eaag muestran una capacidad antioxidante superior a la del ácido l-ascórbico y similar ó superior a otros compuestos antioxidantes, tanto naturales como sintéticos ampliamente utilizados en la industria alimentaria. Estos resultados demuestran que el d-eaa y d-eaag, podrían ser utilizados como agentes antioxidantes en la industria alimentaria y farmacéutica, tanto humana como animal, así como en la industria cosmética, reemplazando a otros antioxidantes de origen sintético tales como el bht o el galato de octilo, que muestran efectos indeseables en la salud. determinamos la capacidad antimicrobiana de 17 compuestos, conocidos ya por sus propiedades antioxidantes, frente a dos especies bacterianas gram-positivas y dos gram-negativas que son alterantes ó patógenas de la leche. Así, estudiamos la actividad antimicrobiana de 7 compuestos naturales y de 7 compuestos sintéticos, frente a dos especies gram-positivas (s. Aureus y b. Cereus) y dos especies gram-negativas (p. Fluorescens y e. Coli). También determinamos la capacidad antimicobiana del l-aa, d-eaa y d-eaag, formando un grupo por su analogía, frente a una especie gram-positiva (s. Aureus) y una especie gram-negativa (e. Coli). En todos los casos se estudiaron las diferencias intraespecíficas e interespecíficas. Para comprobar la capacidad antimicrobiana de los distintos compuestos se determinaron los distintos valores de cmi (concentración mínima inhibitoria) de cada uno de ellos, definiéndose la cmi como la concentración más pequeña de un compuesto capaz de inhibir el crecimiento de las diferentes especies bacterianas. Además, se determinaron las cmbs (concentraciones mínimas bactericidas) de dos compuestos naturales (hidroquinona y carvacrol) y de dos compuestos sintéticos (pg y thbq) frente a dos cepas bacterianas de cada especie, la más resistente y la más sensible. es de destacar la mayor efectividad de los esteres del ácido gálico, el galato de octilo y de propilo respecto a dicho ácido, poniendo de manifiesto la importancia de los grupos apolares en la efectividad de los compuestos antimicrobianos, ya sea frente a especies gram-positivas como frente a especies gram-negativas. Además, comentar la efectividad de los compuestos timol y carvacrol frente a las cuatro especies bacterianas ensayadas, podría deberse a la liberación de protones dentro de las células causando una acidificación citoplasmática, de manera que se produce un bombeo de protones al exterior con el consecuente consumo de atp, originándose una situación de estrés energético y la consiguiente muerte celular. la capacidad antimicrobiana mostrada por el d-eaa y d-eaag fue, en general, menor que la mostrada por los otros compuestos fenólicos. No obstante, sería necesario profundizar en estos estudios para comprobar si pueden ser utilizados en combinación con compuestos fenólicos efectivos, obteniendo un efecto sinergístico en su acción antimicrobiana.
Datos académicos de la tesis doctoral «Control de microorganismos alterantes y patógenos de la leche y queso de oveja de la provincia de león por d-eritroascorbato, un análogo natural de la vitamina c, y otros antioxidantes utilizados en la industria alimentaria«
- Título de la tesis: Control de microorganismos alterantes y patógenos de la leche y queso de oveja de la provincia de león por d-eritroascorbato, un análogo natural de la vitamina c, y otros antioxidantes utilizados en la industria alimentaria
- Autor: Marta Gutiérrez Larraínzar
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 26/03/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María Del Pilar Del Valle Fernández
- Tribunal
- Presidente del tribunal: angel Reglero chillon
- pablo Hueso pérez (vocal)
- arturo Pérez eslava (vocal)
- almudena Fernández briera (vocal)