Tesis doctoral de Cristina Ruiz Herguido
Varios son los estudios que demuestran un papel regulador importante de la vía canónica de wnt en los progenitores y células madre hematopoyéticas en la vida adulta (willert, k. Et al., 2003; reya, t. Et al., 2003; zhao, c. Et al., 2007). Todos estos estudios demuestran que la vía canónica de wnt y su correcta señalización son críticos para mantener la homeostasis normal de las hsc tanto in vitro como in vivo pero se desconoce su papel en la generación de las primeras hsc durante el desarrollo embrionario. el objetivo principal de esta tesis doctoral es determinar el posible papel de la vía canónica de wnt en la fomación de hsc en el embrión de ratón. en primer lugar, se analizó el patrón de expresión de los ligandos de la vía de wnt mediante rt-pcr cuantitativa en la región de la agm, la cual incluye la aorta dorsal. para estudiar en detalle la expresión de los ligandos wnt en la aorta dorsal y saber qué células exactamente los estan expresando se realizaron hibridaciones in situ. Algunos ligandos se expresaban en las células endoteliales de la aorta y también en el mesénquima adyacente y mesonefros, mientras que otros daban un patrón de expresión negativo. sabiendo que algunos ligandos wnt se expresaban en el endotelio de la aorta dorsal y en los clusters hematopoyéticos el siguiente paso fue analizar si la vía canónica de wnt estaba activada en estas células. la presencia de la íY-catenina (principal efector de la vía canónica de wnt) en el núcleo correlaciona con la activación de la vía canónica de wnt por ello, se realizaron inmunofluorescencias en cortes transversales de embriones a día de desarrollo e10.5. Se obtuvo un claro marcaje en la membrana de las células del endotelio de la aorta pero sólo algunas de ellas tenían marcaje nuclear (no mostrado). Para saber si las células del endotelio que tienen activada la vía canónica de wnt son hsc se realizaron dobles inmunofluorescencias en embriones a día e10.5. Se utilizo c-kit como marcador de hsc y su expresión queda restringida a los clusters hematopoyéticos (los cuales contienen las hsc). Todas las células del endotelio presentan un claro marcaje en la membrana y sólo unas pocas tienen marcaje nuclear. Mientras que las células c-kit+ no presentaban marcaje nuclear las células endoteliales presentes en la base de los clusters sí sugiriendo que los progenitores que dan lugar a los clusters hematopoyéticos tienen activada la vía canónica de wnt. para estudiar el efecto que esta causando la activación de la vía en estas células se realizaron cultivos de explante utilizando agms a diferentes días de desarrollo y tratándolas con activadores (sb216763 o fratide) e inhibidores (pkf115-584) de la vía canónica de wnt. Se escogio este tipo de cultivos porque mantienen y amplifican las hsc y tras 3 días en cultivo se analizaron los progenitores hematopoyéticos mediante el ensayo de cfcs o células formadoras de colonias. La activación de la vía produjo un aumento del número total de progenitores hematopoyéticos mientras que la inhibición disminuyo drasticamente la formación de estos progenitores sugiriendo que la vía canónica de wnt esta involucrada en la generación de estos progenitores. En diversos estudios se ha demostrado la existencia de un precursor comun en el endotelio de la aorta capaz de producir tanto células hematopoyéticas y endoteliales conocido con el nombre de hemangioblasto. Con el fin de investigar si la vía de wnt esta regulando la decisión entre endotelio o célula hematopoyética se aislaron por citometría de flujo células endoteliales (cd31+/cd45-) a partir de agms a e11.5 y se mantuvieron en cultivo líquido, tratándolas con sb y frat para activar la vía de wnt. En las gráficas de la figura 4 se resumen los resultados obtenidos que muestran como la activación de la vía canónica de wnt produjo una disminución de las células endoteliales (cd31) aumentando la población hematopoyética (cd45). Estos resultados correlacionan con los obtenidos al inhibir la vía utlizando cultivos de explante en los que obtuvimos un claro aumento de células endoteliales y una disminución de la población hematopoyética. por último, estudiamos la hematopoyesis de los embriones mutantes apc, que tienen mutada una copia del gen apc y por tanto tienen una mayor activación de la vía canónica, con el fin de estudiar de una manera más fisiológica la vía de wnt. Se estudiaron las hsc de la agm y del hígado fetal y se vio que la capacidad de auto renovación de las hsc presentes en la agm e hígado fetal de los embriones mutantes estaba severamente afectada utilizando ensayos de transplante secundario a ratones irradiados. objetivos logrados o conclusiones ¿ algunas células del endotelio de la aorta dorsal tienen activada la vía canónica de wnt y probablemente esta activación este involucrada en la generación de las células madre hematopoyéticas (hsc). ¿ más específicamente, la vía canónica de wnt podría estar afectando la decisión entre los linajes hematopoyético y endotelial durante la generación de las hsc. ¿ los embriones mutantes apc tienen afectada la autorenovación de las hsc.
Datos académicos de la tesis doctoral «Papel wnt en la hematopoyesis embrionaria«
- Título de la tesis: Papel wnt en la hematopoyesis embrionaria
- Autor: Cristina Ruiz Herguido
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 30/04/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Anna Bigas Salvans
- Tribunal
- Presidente del tribunal: cristina Pujades corbi
- sergio Querol giner (vocal)
- (vocal)
- (vocal)