Tesis doctoral de María Raquel Lopez Fontal
Introducción……………………..23 1 inflamación…………………………………………………………………………………………………………..23 1.1 los tlr (toll-like receptor) y otros sensores de patógenos del sistema inmunitario innato. ……………………………………………………………………………………………….25 1.1.1 familia de receptores tlr………………………………………………………………………………….26 1.1.2 vías de señalización mediadas por tlr……………………………………………………………….28 regulación negativa de las vías de señalización de los tlr. …………………………………..30 1.2 nfb en la respuesta inflamatoria …………………………………………………………………………..30 1.3 citoquinas, mediadores de la respuesta inflamatoria…………………………………………………..32 1.4 macrófagos en el proceso inflamatorio ……………………………………………………………………33 1.5 choque séptico y tlr4………………………………………………………………………………………….36 2 nuevos reguladores de la inmunidad innata: papel de los genes supresores de tumores ………………………………………………….38 2.1 el locus ink4a/arf y la proteína arf……………………………………………………………………….39 locus ink4a/arf………………………………………………………………………………………………..39 la proteína arf ……………………………………………………………………………………………….40 2.2 papel biológico de arf…………………………………………………………………………………………42 2.2.1 funciones anti-proliferativas ………………………………………………………………………………42 supresor tumoral dependiente de p53…………………………………………………………………..43 supresor tumoral independiente de p53………………………………………………………………..44 anti-proliferativo en el desarrollo………………………………………………………………………..44 2.2.2 función anti-viral………………………………………………………………………………………………45 2.3 mecanismos de acción de arf ……………………………………………………………………………….45 2.3.1 actividad anti-ubiquitina-ligasa y secuestro en el nucleolo……………………………………..45 2.3.2 sumoilación ……………………………………………………………………………………………………..46 2.3.3 control ribosomal ……………………………………………………………………………………………..46 2.3.4 actividad mitocondrial ………………………………………………………………………………………48 2.3.5 unión a múltiples proteínas celulares …………………………………………………………………..48 índice objetivos……………………………..53 materiales y métodos……………………………………………………………………………………………………….57 1 materiales……………………………………………………………………………………………………………………….57 1.1 reactivos …………………………………………………………………………………………………………………57 1.2 animales …………………………………………………………………………………………………………………58 2 métodos…………………………………………………………………………………………………………………………….60 2.1 análisis de genotipo …………………………………………………………………………………………………..60 2.2 extracción de dna de cola de ratón …………………………………………………………………………….62 2.3 obtención de cultivos primarios…………………………………………………………………………………..62 2.3.1 aislamiento y cultivo de macrófagos peritoneales …………………………………………………62 2.3.2 obtención y cultivo de macrófagos derivados de médula ósea (bmdm) ………………….63 2.4 cultivo de fibroblastos embrionarios murinos (mefs) ……………………………………………………64 2.5 medida de citoquinas en el medio de cultivo …………………………………………………………………64 2.6 determinación de la síntesis de no ……………………………………………………………………………..64 2.7 cuantificación de rna y pcr cuantitativa en tiempo real………………………………………………65 2.7.1 aislamiento de rna………………………………………………………………………………………….65 2.7.2 rt-pcr …………………………………………………………………………………………………………..65 2.7.3 pcr cuantitativa o en tiempo real (q-pcr) ………………………………………………………….66 2.7.4 microarray de dna ………………………………………………………………………………………….67 2.8 preparación de extractos citosólico y nuclear…………………………………………………………………68 2.9 preparación de extracto total. ………………………………………………………………………………………68 2.10 determinación de la concentración de proteínas …………………………………………………………….69 2.11 análisis de proteínas por western-blot…………………………………………………………………………69 2.11.1 electroforesis y transferencia………………………………………………………………………………69 2.11.2 inmunodetección……………………………………………………………………………………………….69 2.12 extracción y preparación de tejidos y tinciones histoquímicas …………………………………………70 2.12.1 inclusión de tejidos por congelación y sección en criostato …………………………………….70 2.12.2 inclusión de tejidos en parafina y sección en microtomo. ……………………………………….70 2.12.3 tinción de cortes histológicos: hematoxilina-eosina (he)……………………………………..71 2.13 ensayo de unión al dna del factor de transcripción nfb (p65)…………………………………….71 2.14 preparación de plásmidos……………………………………………………………………………………………72 2.14.1 transformación de bacterias competentes. ……………………………………………………………72 2.14.2 crecimiento de bacterias transformadas y purificación de plásmidos. ………………………72 índice 2.15 transfección de macrófagos………………………………………………………………………………………..73 2.16 transfección de vectores en células hek293t………………………………………………………………73 2.17 análisis por citometría de flujo de las poblaciones leucocitarias ………………………………………74 2.18 detección de marcadores de superficie mediante citometría de flujo. ……………………………….74 2.19 ensayos de adhesión…………………………………………………………………………………………………..74 2.19.1 adhesión estática ………………………………………………………………………………………………74 adhesión celular a proteínas de matriz extracelular. ………………………………………………74 co-adhesión celular macrófago-endotelio …………………………………………………………….75 2.19.2 en flujo ……………………………………………………………………………………………………………76 2.20 análisis de sangre periférica ……………………………………………………………………………………….76 2.20.1 recuento de poblaciones celulares sanguíneas ………………………………………………………76 2.20.2 extracción de plasma sanguíneo………………………………………………………………………….76 cuantificación de citoquinas en plasma………………………………………………………………..76 análisis de actividades enzimáticas……………………………………………………………………..77 2.21 peritonitis inducida con tioglicolato ……………………………………………………………………………..77 2.22 edema en oreja de ratón y actividad mieloperoxidasa (mpo) ………………………………………….77 2.22.1 determinación de la actividad (mpo) en oreja………………………………………………………77 2.23 choque endotóxico inducido por lps…………………………………………………………………………..78 2.24 análisis estadístico …………………………………………………………………………………………………….78 resultados……………………………………………………………………………………………………………………………..81 1 la ausencia de p19arf provoca la disminución de las citoquinas inflamatorias en respuesta ligandos de los tlr………………………………………………..81 1.1 respuesta a tlr4 ……………………………………………………………………………………………………..81 1.2 respuesta a otros tlr ……………………………………………………………………………………………….87 2 el déficit de p19arf afecta a la liberación de mediadores inflamatorios…………………………………………………………………………………………………………………89 3 la ausencia de p19arf disminuye la activación nfb y las mapk en macrófagos estimulados con lps. ……………………………………………………………………………91 4 la regulación de la expresión de los tlr en los ratones p19arf-/- está alterada…………………………………………………………………………………………………………………………..93 4.1 regulación de la expresión del locus ink4a …………………………………………………………………..93 4.2 regulación de la expresión de los tlr…………………………………………………………………………96 5 la sobre-expresión de p19arf rescata el fenotipo de las células p19arf-/-……………………………………………………………………………………………………….
Datos académicos de la tesis doctoral «Papel del supresor tumoral p19arf en la respuesta inflamatoria«
- Título de la tesis: Papel del supresor tumoral p19arf en la respuesta inflamatoria
- Autor: María Raquel Lopez Fontal
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 30/04/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Lisardo Boscá Gomar
- Tribunal
- Presidente del tribunal: federico Mayor menendez
- eleuterio Lombardo de la camara (vocal)
- alfonso Luque jimenez (vocal)
- paloma Martín sanz (vocal)