Tesis doctoral de Raúl González Urdiales
La utilización de semen porcino criopreservado para la inseminación artificial comercial podría reportar numerosas ventajas, tales como el mayor control sanitario, la gran disponibilidad espacio/temporal, la estabilidad frente a variaciones climáticas o la posibilidad de incorporar a las explotaciones genética de alto valor con un coste más reducido, pero en la práctica su uso se ve muy restringido, principalmente por la sustancial reducción del rendimiento reproductivo que presenta con respecto a las dosis seminales refrigeradas. Por este motivo, y dado que la realización de una criopreservación óptima del semen ha sido considerada como un prerrequisito esencial para la utilización de esta técnica de conservación a nivel comercial, los trabajos de investigación han ido dirigidos a intentar perfeccionarla. la amplia variabilidad en los resultados obtenidos con semen de verraco en cuanto a la supervivencia celular frente a procesos de enfriamiento y descongelación, dadas las notables diferencias existentes no sólo entre razas sino también entre individuos, hace que sea necesario realizar una selección de animales basada en la capacidad de criopreservación de su semen, y aunque se ha apuntado una posible influencia genética en esta variabilidad posdescongelado, hasta el momento no existen publicaciones que recojan modelos de selección genética basados en la congelabilidad del semen; de hecho, únicamente se ha englobado a los diferentes animales estudiados en categorías de buenos y malos congeladores con base en las características seminales posdescongelado, sin haber conseguido extraer buenas relaciones entre éstas y otras que definan a los verracos de forma previa a la congelación/descongelación del semen. Por otro lado, la existencia de variaciones tras la descongelación entre eyaculados de un mismo verraco, hecho que parece responder a cambios de las propiedades bioquímicas de los espermatozoides como consecuencia, entre otras causas, de variaciones en la frecuencia de colección o de la época del año, hace que la determinación de algún indicador de la capacidad de criopreservación de un eyaculado en sus características seminales antes de congelar, resulte tanto o más interesante que la propia selección de animales. en este sentido, el principal objetivo de este trabajo ha sido determinar la eficacia de sencillas pruebas de laboratorio en la predicción de la supervivencia espermática al proceso de criopreservación, para lo cual fueron desarrollados dos experimentos en un intento de identificar factores relacionados con la variabilidad posdescongelado en 40 eyaculados procedentes de 8 verracos (5 congelaciones por verraco) de dos razas diferentes (large white [20 congelaciones] y landrace [20 congelaciones]). En el primero de ellos, se evaluaron pruebas que habitualmente se emplean en las valoraciones seminales que se efectúan en los centros de ia comerciales sobre el semen fresco, tratando mediante ellas de relacionar la adaptación de las células a determinadas situaciones de estrés (osmótico, por calor, o por frío) con la resistencia que manifiestan al proceso completo de criopreservación. La capacidad de adaptación a un estrés osmótico fue valorada por medio de pruebas de host (de 30 y 60 minutos de incubación) y de ort (de 60 y 120 minutos de incubación) con soluciones hiposmóticas ajustadas a 100mosm/kg, la de adaptación a un estrés por calor, mediante la incubación de las muestras seminales diluidas a 39 ºc durante 7 horas, evaluando la integridad de las membranas plasmática y acrosómica, así como el porcentaje de movilidad (con y sin cafeína) a la hora y media (t1,5), a las tres (t3), a las cuatro horas y media (t4,5) y a las siete horas (t7); y finalmente, en la resistencia espermática a un descenso brusco de temperatura, se valoraron esos mismos parámetros tras someter las muestras a temperaturas de 0 ºc durante 5 minutos en diferentes momentos: a los 10 minutos de comenzar una incubación a 20 ºc (s0), a la hora (s1), a las dos (s2), a las tres (s3) y a las cinco horas (s5). por su parte, en el segundo experimento se analiza si las características del movimiento de los espermatozoides en semen fresco, y en cada uno de esos puntos de referencia establecidos en el estrés por calor (termorresistencia) o por frío (choque por frío), muestran evidencias de la capacidad de criopreservación de los eyaculados; para ello, se efectuó un estudio pormenorizado de la cinética espermática a través del análisis individualizado de los parámetros que nos aporta el sistema isas® de proiser r+d y también de forma conjunta mediante el estudio de subpoblaciones espermáticas, para lo cual utilizamos un procedimiento compuesto por un agrupamiento no jerárquico inicial mediante el método de las k-means, para posteriormente aplicar el algoritmo de agrupamiento jerárquico aglomerativo de ciampi et al. (2007). la aproximación a la relación existente entre la congelabilidad de los eyaculados y las características que éstos presentan en cada una de las pruebas realizadas, se ha efectuado analizando la respuesta que a ellas han tenido los eyaculados clasificados en función de su capacidad de congelación (buena, media o mala congelabilidad), así como por medio de coeficientes de correlación y análisis de regresión múltiple. dentro de la batería de pruebas que habitualmente se realizan de forma rutinaria a un eyaculado, la concentración, la normalidad morfológica de las células y la integridad de la membrana plasmática y la de la acrosómica fueron en este estudio las más relacionadas con la capacidad de criopreservación, presentando coeficientes de correlación de hasta r=0,677 en el caso de la concentración del eyaculado. La utilización de este tipo de pruebas de rutina resultó muy interesante, ya que consiguió explicar por medio del análisis de regresión múltiple un 55,6% de la variabilidad posdescongelado a partir de las tres primeras variables de las cuatro citadas. en cuanto al estrés osmótico, la respuesta al ort resultó más determinante que la del host, tanto por haber conseguido detectar de una forma más eficiente una respuesta estadísticamente diferente de los grupos de buenos, medios y malos congeladores, como por presentar una mayor relación con los índices posdescongelación calculados, mostrando coeficientes de correlación con todos ellos en un rango que oscila de r=0,412 a r=0,557. Sin embargo, y a pesar de la importancia de adaptación de la célula a las variaciones osmóticas del proceso de criopreservación, en la supervivencia espermática al mismo, no pudimos determinar, a partir de estas pruebas, más de un 21,6% de la variabilidad mostrada por las muestras seminales descongeladas. por su parte, la termorresistencia no parece ser una prueba recomendable para tratar de estimar la congelabilidad de los eyaculados, puesto que a medida que avanza el tiempo de permanencia a 39 ºc, se ven disminuidos tanto los coeficientes de correlación como el porcentaje de variabilidad que es posible explicar por medio de la regresión múltiple (de un 25,8% en el t1,5 a un 12,6% en el t7). En cambio, el sometimiento de las muestras seminales a un descenso brusco de temperatura experimentó el efecto contrario, pues la incubación a 20 ºc, aparte de conferir a las muestras una mayor resistencia al choque a frigore, permitía pasar de resultados no más importantes que los del resto de pruebas a, posiblemente, los más interesantes, tanto respecto al comportamiento de los grupos establecidos en función de su aptitud frente a la criopreservación, como en cuanto a los coeficientes de correlación obtenidos (llegando a valores de r=0,803) o a los resultados recogidos con la regresión múltiple que, con la inclusión de un único parámetro en los modelos establecidos, se incrementaron de un 29,5% en el s0, a un 58,3% en el s5. en el segundo experimento se recoge en las muestras descongeladas un incremento con respecto al semen fresco de prácticamente todos los parámetros cinéticos (excepto el wob), caracterizándose aquellos eyaculados con una mayor capacidad de criopreservación por velocidades (vcl, vsl y vap) significativamente más elevadas. La capacidad de predicción de la congelabilidad que mostraron los parámetros cinéticos individualizados, tanto en semen fresco como en los diferentes tiempos de incubación de la termorresistencia no fueron esencialmente superiores a los obtenidos en el primer experimento con esas mismas muestras, si bien destaca la inclusión de la bcf en todos los modelos de regresión establecidos, sugiriendo una posible relevancia de este parámetro como indicador de la resistencia al proceso de congelación/descongelación. A partir de las características cinéticas de las células después de sufrir un choque por frío se recogieron coeficientes de correlación de hasta 0,589, probablemente por la similitud existente entre el daño celular provocado por este choque y el ocasionado por la criopreservación, si bien, al contrario que en el primer experimento, a medida que transcurre la incubación todos los indicadores analizados en busca de relaciones con la congelabilidad van disminuyendo de forma considerable, pasando de una explicación máxima de la variabilidad posdescongelado del 48,3% en el s1 a un valor mínimo de 7,9% tras el s5. la determinación de subpoblaciones se efectuó a partir de los valores de los parámetros cinéticos de las muestras recién recogidas (t0), agrupando a los espermatozoides en tres subpoblaciones (sp1, sp2 y sp3) con características cinéticas diferenciadas, de modo que en la sp1 se incluyeron las células que presentaban movimientos progresivos y una alta velocidad lineal, en la sp2 las que describían trayectorias sinuosas y mostraban una velocidad circular elevada, mientras que la sp3 englobaba espermatozoides con unos parámetros cinéticos degradados. El porcentaje relativo de estas subpoblaciones varía tanto tras el proceso de criopreservación, incrementándose la sp1 y disminuyendo la sp3, como con la termorresistencia, caracterizándose por un aumento de la sp1 y una disminución de las otras dos, aunque la sp3 sufre un incremento considerable en el t7, así como tras los choques por frío, con los que sufre un incremento espectacular la sp2 y un descenso la sp1 y la sp3. No obstante, a partir de la variación de estas subpoblaciones no se obtuvo una mejor predicción de la congelabilidad que con los parámetros cinéticos analizados de forma individual, ni en el t0, ni en la termorresistencia, ni mediante los choques por frío, con explicaciones máximas de la variabilidad posdescongelado de un 7,8, un 10,3 y un 24,7%, respectivamente, si bien se deduce a partir de las correlaciones calculadas, la importancia de un determinado tipo de movimiento espermático, fundamentalmente tras el choque por frío, como se evidencia en las correlaciones positivas con la congelabilidad de la sp2 y las negativas de la sp1. atendiendo a la importancia mostrada por el choque a frigore en cuanto a una posible predicción de la congelabilidad de un eyaculado, se desarrolló un tercer experimento con el fin de ahondar en algunos aspectos que pueden incidir en la resistencia espermática al enfriamiento, como el estado de maduración espermática, el plasma seminal (ps) y el diluyente comercial empleado en la dilución de las muestras, además de determinar la influencia sobre la supervivencia espermática a la criopreservación del incremento de la resistencia al frío generado al aumentar el tiempo de incubación previo. para analizar la influencia de la presencia de gotas citoplasmáticas como indicadora de inmadurez, se evaluó a lo largo de tres horas de incubación a 20 ºc la variación porcentual, con respecto a los valores del eyaculado, que experimentaban los espermatozoides vivos clasificados como morfológicamente normales, los que mantenían una gota citoplasmática distal o proximal en su estructura y los de otras categorías morfológicas, concluyendo que la presencia de una gota citoplasmática en la estructura de células eyaculadas puede ser considerada un indicador de inmadurez, como consecuencia de la menor sensibilidad mostrada por éstas frente al choque por frío, lo cual sería indicativo de que no han sufrido los procesos de maduración epididimaria que incrementan la susceptibilidad al descenso térmico, que tienen lugar en las porciones distales del cuerpo del epidídimo y, por tanto, tampoco los que acontecen en una zona posterior, con las posibles repercusiones negativas que ello tendría sobre la fertilidad. por otra parte, para analizar la influencia del diluyente comercial empleado así como de la presencia del plasma seminal (ps), se dividió la fracción rica de los eyaculados empleados en seis porciones, tres diluídas con bts y las otras tres con mr-a, y en cada caso a una de las tres le fue retirado el ps por centrifugación en un primer momento tras la eyaculación, a la segunda instantes antes de realizar cada choque y la tercera permaneció en contacto con él durante toda la prueba, concluyendo que tanto la composición del diluyente comercial empleado como la presencia del ps en las muestras influyen de forma determinante en la resistencia celular; así, la utilización de mr-a resultó mucho más adecuada que la de bts para este fin, posiblemente por el contenido en bsa y cisteína del primero, y también resultó conveniente la presencia de plasma seminal, pues se obtuvieron mayores porcentajes de integridad de las membranas acrosómica y plasmática a partir de la hora de incubación en las muestras que se mantuvieron en contacto con él, pero mostrando una tendencia a empeorar si el ps continuaba durante la realización de los choques a frigore. por último, al modificar el protocolo de criopreservación aumentando el periodo de estabilización a 15 ºc de 3 horas a 6, 12 y 24 horas, se observó un notable incremento en la resistencia de las membranas plasmática y acrosómica, tanto al choque por frío como al proceso completo de congelación/descongelación, a medida que aumentaban las horas de permanencia a la citada temperatura, si bien no sería positivo llegar hasta las 24 horas, a tenor del marcado descenso en la movilidad espermática observado en este punto, tanto tras el choque y tras la criopreservación, así como por el manifiesto descenso en la calidad de las muestras seminales por el mero hecho de mantenerlas en refrigeración durante tanto tiempo.
Datos académicos de la tesis doctoral «Valoración de la capacidad de criopreservación espermática del semen porcino mediante técnicas de choque a frigore y termorresistencia.«
- Título de la tesis: Valoración de la capacidad de criopreservación espermática del semen porcino mediante técnicas de choque a frigore y termorresistencia.
- Autor: Raúl González Urdiales
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 28/05/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Jesús Peláez García De La Puerta
- Tribunal
- Presidente del tribunal: félix Pérez pérez
- Manuel Castejón limas (vocal)
- carles Soler vazquez (vocal)
- José felix Pérez gutiérrez (vocal)