Tesis doctoral de Jana Rohacova
Los ácidos biliares son esteroides biosintetizados en el hígado que actúan como tensoactivos, facilitando la digestión de los lípidos. Para ello, circulan y se reutilizan en un movimiento conocido como circulación enterohepática, un proceso muy complejo en el que no todas las etapas están perfectamente entendidas. Con el propósito de estudiar algunos aspectos relacionados con la circulación enterohepática, en la presente tesis doctoral se planteó preparar derivados fotoactivos de ácidos biliares para estudiar su comportamiento con modelos celulares para detectar efectos colestásicos de fármacos; y por otra parte, estudiar las interacciones con albúmina sérica humana, el transportador mayoritario de los ácidos biliares en la última etapa de la circulación enterohepática. la síntesis de derivados fluorescentes de ácidos biliares, principalmente ácido cólico, se basó en la condensación del ácido biliar mediante unión covalente con diversos fluoróforos, en concreto aminofluoresceína, nitrobenzofurazano, dansilo, carprofeno, aminoftalimida y bimano. La aminofluoresceína se conjugó con el ácido cólico por el grupo carboxílico mientras que el resto de los fluoróforos mencionados se conjugaron por un grupo amino del ácido cólico, previamente obtenido de forma estereoselectiva a partir del correspondiente hidroxilo. una vez preparados los análogos de los ácidos biliares, se llevó a cabo su caracterización fotofísica. en concreto, los derivados de aminofluoresceína, nitrobenzofurazano y dansilo se han caracterizado completamente; así se ha determinado sus espectros absorción y emisión, tiempos de vida y energías de singlete, así como rendimientos cuánticos. Los estados excitados singlete mostraron ser sensibles al medio. para el resto de los compuestos se han establecido sus propiedades fotofísicas más importantes del estado singlete. a continuación, los derivados de nitrobenzofurazano y dansilo se elegieron para examinar sus interacciones con albúmina sérica humana. Gracias a los cambios en absorción, emisión y tiempos de vida observados en presencia de hsa, se comprobó la formación de complejos y estableció la estequiometría de los mismos. Se determinaron las constantes de asociación y finalmente se asignaron los sitios de unión a la hsa mediante experimentos de desplazamiento. Los derivados de nitrobenzofurazano han resultado una buena aproximación al ácido cólico natural (los valores obtenidos para kb eran del mismo orden que los descritos y se ha demostrado que el fluoróforo no era determinante para el reconocimiento de la unión específica al sitio 1). finalmente, se han puesto a punto ensayos con modelos celulares utilizando la técnica de citometría de flujo con los derivados fluorescentes del ácido cólico. Los derivados de nitrobenzofurazano y dansilo han demostrado ser captados específicamente por los hepatocitos en suspensión, con cinéticas diferentes. Los más eficientes han sido los derivados 3¿-, en ambos casos. Así, se han optimizado ensayos con hepatocitos para monitorizar la captación hepática en presencia de fármacos colastásicos validada cuantificando su efecto inhibidor.
Datos académicos de la tesis doctoral «Síntesis de derivados fotoactivos de ácidos biliares para aplicaciones biológicas«
- Título de la tesis: Síntesis de derivados fotoactivos de ácidos biliares para aplicaciones biológicas
- Autor: Jana Rohacova
- Universidad: Politécnica de Valencia
- Fecha de lectura de la tesis: 04/06/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María Luisa Marín García
- Tribunal
- Presidente del tribunal: agusti Lledos falco
- Fernando Jorge Da silva pina (vocal)
- pablo José Ballester balaguer (vocal)
- luca Prodi (vocal)