Tesis doctoral de Pablo Gutiérrez Toral
Los posibles efectos beneficiosos para la salud humana de algunos ácidos grasos con propiedades bioactivas, como es el caso del isómero cis-9, trans-11 del ácido linoleico conjugado (cla), han motivado un gran interés en el desarrollo de estrategias nutricionales que permitan aumentar su concentración en la leche de los rumiantes. la suplementación de la dieta con aceites vegetales y lípidos de origen marino es una estrategia efectiva para modificar la composición de la grasa láctea en el ganado vacuno lechero. Sin embargo, el número de estudios llevados a cabo en el ovino es aún muy limitado, aunque algunos trabajos han mostrado que la inclusión en la dieta de ovejas de un aceite rico en 18:2n-6, como es el de girasol, aumenta el contenido del cis-9, trans-11 cla de la leche sin perjudicar al rendimiento productivo de los animales. En las vacas, se sabe que el uso de aceite de girasol junto con lípidos de origen marino (ricos en ácidos grasos n-3 de cadena larga) induce aumentos incluso mayores en la concentración de este isómero del cla en la leche, así como la transferencia a esta de 20:5n-3 y 22:6n-3. No obstante, dicha estrategia de suplementación ha sido sistemáticamente relacionada con el denominado síndrome de baja grasa en la leche, al cual parece que las ovejas son menos propensas. De todos modos, en el ovino no existe suficiente información al respecto y sería necesaria más investigación. por ello, en esta tesis se llevó a cabo una serie de cinco experimentos con ovejas, correspondientes a los cinco capítulos en los cuales se divide la memoria, con el objetivo de investigar el efecto de la suplementación con aceite de girasol y, o bien aceite de pescado, o bien microalgas marinas, sobre la composición de los ácidos grasos de la leche y de la digesta, la microbiota y la fermentación ruminal, y el rendimiento productivo de los animales. en el estudio descrito en el capítulo i, una dieta rica en alimentos concentrados, formulada para ovejas lecheras de alta producción, se suplementó con aceites de girasol (so) y de pescado (fo), tanto de forma individual como conjunta, para evaluar su impacto sobre el perfil de ácidos grasos de la leche y el rendimiento productivo de los animales. Sesenta y cuatro ovejas de raza assaf se distribuyeron en 8 lotes de 8 animales cada uno y se asignaron a 4 tratamientos (2 lotes/tratamiento): dieta sin suplementación lipídica (control) o suplementada con 20 g de so/kg (so), con 10 g de fo/kg (fo), o con 20 g de so más 10 g de fo/kg (sofo). Los días 0, 3, 7, 14, 21 y 28 de experimento se registró la producción de leche y se recogió una muestra para analizar su composición, incluyendo un perfil completo de ácidos grasos mediante análisis complementarios de cromatografía de gas-líquido y ag+-hplc. La ingestión de alimento tendió a ser menor con la suplementación con fo, en comparación con el tratamiento control (-15%) y el uso combinado de so y fo (es decir, sofo) provocó, además, una disminución significativa de la producción de leche (-13%). Todos los suplementos lipídicos redujeron el contenido proteico de la leche y, en el caso del fo, también disminuyó el contenido graso, hasta un 21% cuando se administró solo (fo) y hasta un 27% cuando se hizo en combinación con so (sofo). Aunque los mecanismos responsables del síndrome de baja grasa en la leche causado por el aceite de pescado aún no están bien definidos, la concentración de trans-10, cis-12 cla en la leche fue siempre baja y no mostró variaciones importantes con el tiempo, lo cual descartaría que este isómero del cla fuera el principal responsable de la disminución del contenido graso de la leche. Por el contrario, la reducción podría haber estado relacionada con el aumento de algunos ácidos grasos trans que son supuestos inhibidores de la síntesis grasa, como por ejemplo el trans-9, cis-11 cla, junto con la caída de un 63% del contenido de 18:0 (lo cual coincidiría con la teoría de la disminución de la fluidez de la grasa de la leche). Comparada con el control, la suplementación con so o sofo mejoró el contenido lácteo de ácidos grasos n-3 de cadena larga, principalmente el 22:6n-3 (que mostró contenidos medios de 0,29 y 0,38% sobre el total de ácidos grasos en las dietas sofo y fo, respectivamente), y redujo la relación de ácidos grasos n-6:n-3 hasta aproximadamente la mitad del valor obtenido para el control, lo cual podría ser de gran importancia para la salud humana. Todos los suplementos lipídicos dieron lugar a niveles elevados de trans-18:1, principalmente trans-11 18:1. Sin embargo, produjeron también un incremento del trans-10 18:1, lo cual hace que no se pueda considerar que esta leche tiene un perfil más saludable de ácidos grasos hasta que se determine el papel específico de cada uno de ellos y se asegure que este trans-18:1 es, al menos, inocuo en relación al riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares. dado que el uso conjunto de so y fo provocó las mayores modificaciones en el rendimiento productivo de los animales y en la composición de los ácidos grasos de la leche, los estudios descritos en los capítulos ii, iii y iv se refieren solo a esta combinación de aceites, y fueron diseñados para examinar su efecto sobre la función ruminal (incluida la fermentación de la dieta y la biohidrogenación de los ácidos grasos) y la comunidad bacteriana. el segundo trabajo (capítulo ii) se realizó con ovejas canuladas e incluyó estudios in vivo, in situ e in vitro, con el objetivo de determinar si las alteraciones observadas en el rendimiento productivo de los animales durante el primer experimento pudieron ser debidas a un impacto negativo de los aceites sobre la fermentación ruminal. Cuatro ovejas canuladas en el rumen fueron alimentadas con la misma dieta control utilizada en el primer estudio, durante un periodo de adaptación de 14 días, y a continuación, se les ofertó la dieta sofo durante 11 días más. Los días 0, 3 y 10 del experimento, se tomaron muestras de fluido ruminal tras 0, 1,5, 3, 6 y 9 h desde la oferta matinal del alimento, para medir su ph y analizar la concentración de amoniaco, lactato y ácidos grasos volátiles (vfa). También se incubó in situ un heno de alfalfa, mediante la técnica de las bolsas de nailon y durante 12 y 24 h, para examinar el efecto de la suplementación con aceites sobre la desaparición de materia seca, proteína bruta y fibra neutro detergente en el rumen. Los días 0 y 11 del experimento, se recogió fluido ruminal justo antes de la oferta de alimento de la mañana para ser usado como inóculo en la incubación in vitro de un heno de alfalfa y de las dietas control y sofo, siguiendo la técnica de producción de gas. Las concentraciones medias de acetato y butirato se redujeron tras la suplementación con aceites y la de vfa totales mostró una tendencia a ser también menor con la dieta sofo (139.0 contra 122.1 mmol/l). Sin embargo, ninguno de los otros parámetros indicativos de la fermentación ruminal in vivo se vio afectado por el tratamiento. La adición de aceites tampoco afectó a la desaparición in situ del heno de alfalfa, ni a los ritmos de producción de gas. Sí se observó, sin embargo, una reducción estadísticamente significativa, pero pequeña, de la producción acumulada de gas en aquellos casos en los que las dietas experimentales fueron incubadas con el fluido ruminal obtenido de los animales alimentados con la dieta que contenía aceites. En conjunto, estos resultados sugieren que la suplementación de una dieta rica en alimentos concentrados con sofo apenas afectó a la fermentación ruminal y, por lo tanto, no se podría descartar su uso para mejorar el valor nutricional de los productos derivados de los rumiantes. el tercer estudio (capítulo iii) también se llevó a cabo con ovejas canuladas y siguió el mismo diseño experimental del capítulo ii. Su objetivo fue examinar los cambios en la acumulación de metabolitos intermedios de la biohidrogenación a lo largo del tiempo, como consecuencia de la inclusión de sofo (20 g de so más 10 g de fo/kg ms) en una dieta rica en alimentos concentrados. Los días 0, 3 y 10 del experimento, se tomaron muestras del contenido ruminal de las ovejas para el análisis detallado de la composición de sus ácidos grasos y, aunque no era el objetivo principal de este trabajo, estudiar algunos parámetros que proporcionaran más información acerca de la influencia de estos aceites sobre la fermentación ruminal. La identificación de los metabolitos intermedios de la biohidrogenación se llevó a cabo mediante el análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas de los derivados 4,4-dimetiloxazolínicos de los ésteres metílicos de los ácidos grasos. Los resultados obtenidos confirmaron que la inclusión de sofo en la dieta no tuvo un efecto negativo sobre el ph, las concentraciones de vfa o la digestión ruminal. Por el contrario, la composición de los ácidos grasos de la digesta ruminal sí se vio alterada, caracterizándose los cambios observados por una reducción a lo largo del tiempo del 18:0 y el 18:2n-6, así como por la acumulación de trans-16:1, trans-18:1, 10-o-18:0 y trans-18:2. Los suplementos lipídicos también aumentaron la proporción de 20:5n-3 y de 22:6n-3 en el contenido digestivo y se observaron aumentos numéricos en las concentraciones de cis-9, trans-11 cla y una disminución en la abundancia relativa de trans-10, cis-12 cla, sin que hubiera evidencia de un cambio en las rutas de biohidrogenación hacia la formación de trans-10 18:1. Además, el análisis minucioso reveló la presencia de varios metabolitos 20:1, 20:2, 22:1, 22:3 y 22:4 únicamente en el contenido digestivo, proporcionando las primeras indicaciones existentes de que el metabolismo ruminal del 20:5n-3, 22:5n-3 y 22:6n-3 podría comenzar con la reducción del doble enlace más cercano al grupo carboxilo. en el capítulo iv, se analizaron los cambios de las comunidades bacterianas del rumen en las ovejas utilizadas durante los experimentos descritos en los capítulos i y iii (es decir, las ovejas en lactación y las canuladas, respectivamente) para investigar el efecto del so y del fo sobre dichas poblaciones microbianas. En este sentido, resulta sorprendente que, a pesar del conocido impacto de la microbiota ruminal sobre la biohidrogenación de los ácidos grasos de la dieta y, por consiguiente, sobre el desarrollo de productos lácteos más saludables, en el ovino no existiera ningún estudio in vivo sobre dicho tema. En primer lugar, en el experimento con ovejas en lactación, se tomaron muestras del fluido ruminal de 4 animales de cada lote, tras 21 días de tratamiento, para la extracción del adn y su análisis mediante hibridación fluorescente in situ (fish). Después, en el experimento con ovejas canuladas, se tomaron muestras del contenido ruminal tras 0, 3 y 10 días de suplementación con sofo, para la extracción del adn y su análisis mediante fish (en el fluido). La abundancia de bacterias totales y del grupo de butyrivibrio en el adn microbiano se estudiaron mediante la técnica del polimorfismo de la longitud de los fragmentos terminales de restricción (t-rflp), mientras que se utilizó la pcr a tiempo real (qpcr) para cuantificar aquellas bacterias del grupo de butyrivibrio productoras de trans-11 18:1 o 18:0. En las muestras de fluido ruminal, se usó la técnica fish para analizar las bacterias totales y de los clusters ix y xiv de los clostridiales. La suplementación de la dieta con sofo indujo cambios importantes en las bacterias totales y en las poblaciones de butyrivibrio, aunque hubo una alta variación interindividual y la velocidad de los cambios dependió de la composición microbiana individual. Los análisis mediante t-rflp y fish mostraron aumentos en unas bacterias del cluster ix, supuestamente microorganismos del género quinella o similares, con la dieta sofo. La t-rflp también mostró un efecto variable de los aceites sobre diversos microorganismos de la familia lachnospiraceae, que incluye aquellas bacterias cultivadas que se sabe que están implicadas activamente en la biohidrogenación ruminal. La abundancia de las bacterias del género butyrivibrio productoras de trans-11 18:1 y de 18:0 respecto al total de bacterias, estimada por qpcr, fue siempre baja (0,28 y 0,18%, respectivamente, en el fluido, y 0,86 y 0,81% en el contenido ruminal), viéndose solo la concentración de las últimas (es decir, de las bacterias productoras de 18:0) reducida en las dietas que contenían fo, aunque de forma significativa únicamente en las ovejas en lactación; mientras que la abundancia de las bacterias del género butyrivibrio productoras de trans-11 18:1 no se vio modificada en ningún caso. Estos resultados sugieren que las bacterias que comúnmente se consideraba que eran las principales responsables de la biohidrogenación ruminal, parecen no tener un papel dominante en este proceso y, por lo tanto, otras bacterias aún no cultivadas podrían ser más relevantes. tras haber finalizado los trabajos con so y fo, se llevó a cabo un último experimento (capítulo v) con el objetivo de estudiar el efecto de la suplementación de la dieta con so más microalgas marinas (ma) sobre el rendimiento productivo de las ovejas y el perfil de ácidos grasos de su leche. Se siguieron los mismos procedimientos experimentales que en la primera prueba (es decir, la descrita en el capítulo i) aunque, en este caso, se evaluaron tres niveles crecientes de ma. Así, cincuenta ovejas de raza assaf se distribuyeron en 10 lotes de 5 animales cada uno y se asignaron a 5 tratamientos (2 lotes/tratamiento): dieta sin suplementación lipídica (control) o suplementada con 25 g de so/kg ms más 0, 8, 16 o 24 g de ma/kg ms (so, soma1, soma2 y soma3, respectivamente). La adición de lípidos no afectó ni a la ingestión de alimento ni a la producción de leche, si bien todas las dietas que incluyeron ma redujeron el contenido de grasa de la leche desde el día 14 en adelante, alcanzándose una disminución del 30% tras 28 días con el tratamiento soma3. Tal y como se mencionó en el caso del síndrome de baja grasa en la leche inducido por fo, la reducción del contenido de grasa láctea podría estar relacionado no solo con la acción sinérgica entre algunos metabolitos supuestamente inhibidores de la síntesis grasa, sino también con la limitada capacidad de la glándula mamaria para mantener la fluidez adecuada de la grasa láctea, lo que estaría relacionado, a su vez, con el marcado aumento de los trans-18:1 y con la menor disponibilidad de 18:0 para la síntesis de cis-9 18:1. Los aumentos del contenido lácteo de cis-9, trans-11 cla fueron mayores en respuesta a la suplementación con soma que cuando se usó solo so, alcanzándose un contenido medio del 3,22% del total de ácidos grasos, lo cual supone un valor 7 veces mayor que el del control. También se mejoró el contenido de trans-11 18:1 (de media, +794% para los tratamientos soma) y el de 22:6n-3, si bien la tasa de transferencia de este último fue muy baja (5%). Aun así, los niveles más altos de soma (soma2 y soma3) resultaron muy eficaces para disminuir la relación de ácidos grasos n-6:n-3 en la leche, lográndose valores tan bajos como un 1,4 tras 28 días de tratamiento. Por el contrario, los suplementos de ma causaron un aumento importante del trans-10 18:1, tal y como se había observado con el uso del fo (capítulo i). por último, esta memoria incluye una discusión general que integra todos los capítulos anteriores. Un aspecto importante de esa sección es la comparación entre los resultados obtenidos en los capítulos i y v, así como la posible relación entre los cambios del metabolismo lipídico en el rumen y las variaciones del perfil de ácidos grasos de la leche.
Datos académicos de la tesis doctoral «Supplementation of the diet of dairy ewes with sunflower oil and marine lipids to modulate milk fat composition. effect on animal performance, rumen microbiota and fermentation characteristics, and milk and digesta fatty acid profiles.«
- Título de la tesis: Supplementation of the diet of dairy ewes with sunflower oil and marine lipids to modulate milk fat composition. effect on animal performance, rumen microbiota and fermentation characteristics, and milk and digesta fatty acid profiles.
- Autor: Pablo Gutiérrez Toral
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 04/06/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Pilar De Frutos Fernández
- Tribunal
- Presidente del tribunal: secundino López puente
- kevin j. Shingfield (vocal)
- Álvaro Belenguer ferrando (vocal)
- ramon Casals costa (vocal)