Tesis doctoral de César Antonio Díaz Alcántara
El objetivo global planteado en esta tesis es el aislamiento, caracterización y selección de rhizobia autóctonos que nodulan habichuela roja (phaseolus vulgaris l.), En la república dominicana que nos permita avanzar hacia una fertilización racional en el cultivo de esta leguminosa mediante la selección de cepas autóctonas de rhizobia de elevada eficiencia en la fijación de nitrógeno, para fabricar con ellas biofertilizantes. el cultivo de la habichuela en la republica dominicana tiene una importancia social y económica significativa, cuya producción primaria hace el mayor aporte económico al desarrollo de toda la región del país, generando una gran cantidad de empleos, tanto directos como indirectos. metodología utilizada para desarrollar los objetivos: los nódulos fueron extraídos de plantaciones de habichuela en estado fenológico de floración en los municipios de constanza, rancho arriba y hondo valle; perteneciente a las provincias de la vega, ocoa y elías piña, respectivamente, de la república dominicana. Los suelos donde se extrajeron los nódulos corresponden a zonas montañosas del país. Por cada parcela se tomaron 15 plantas. Para el aislamiento los nódulos se esterilizaron superficialmente sumergiéndolos en una solución de hgcl2 al 1,0% durante 5 minutos, lavándolos posteriormente en agua estéril. Posteriormente se trituraron con ayuda de una varilla de vidrio estéril y se sembraron en placas con medio de cultivo yma (vincent, 1970). Las placas se incubaron a 28ºc durante una semana, en este tiempo se produjo el crecimiento de colonias de bacterias procedentes del interior del nódulo. Para extraer el dna las cepas se inocularon en placas con medio ty (beringer, 1974) y se incubaron durante 24-48h a 28ºc. Con el adn extraído de cada una de las cepas aisladas y el de las cepas de referencia se llevó a cabo el análisis de los perfiles de tp-rapd mediante pcr utilizando dos primers universales que amplifican el 16s rdna y una serie de bandas adicionales. Los perfiles de tp-rapd permiten agrupar los aislados a nivel de especie o subespecie, y por tanto permiten reducir el número de aislados que se someten a idenficación mediante técnicas más complejas como es la secuenciación de genes. La identificación taxonómica de los representantes de los grupos formados por los tp-rapd, se llevó a cabo mediante la secuenciación de los genes ribosómicos 16s y los genes housekeeping reca y atpd y para la identificación a nivel de biovar se analizaron los genes nodc. También se realízó una caracterización fenotípica, evaluando el crecimiento en diferentes condiciones de ph, temperatura y salinidad. Para comprobar que las cepas aisladas en el estudio eran capaces de de reinfectar, se inocularon plantas de habichuela de la misma variedad en la que se aislaron los rhizobia. Se aislaron un total de 23 cepas, obteniendo 8 grupos tp-rapd, de los cuales 5 estuvieron constituidos por más de una cepa, el mayoritario por 7 cepas. La secuenciación completa del gen ribosómico 16s de una cepa representativa de cada perfil de tp-rapd permitió clasificar las cepas aisladas en el género rhizobium, dos de ellos (grupos i y viii) aparecen con una similitud del 100% con respecto a r. Phaseoli y el resto se identificaron como rhizobium sp. Las secuencias de los genes reca y atpd permitieron confirmar que los representantes de dos grupos de tp-rapd, i y viii, pertenecen la especie rhizobium phaseoli, sin embargo el resto de las cepas posiblemente no pertenecen a ninguna de las especies descritas hasta el momento en este género. Los resultados de la caracterización fenotípica mostraron que las cepas aisladas en este estudio son próximas a las dos especies americanas que son microsimbiontes típicos de phaseolus, rhizobium etli y rhizobium phaseoli. En consecuencia puede afirmarse que en los suelos analizados de república dominicana, phaseolus vulgaris establece simbiosis con rhizobia de crecimiento rápido, mostrando gran diversidad. Todas las cepas de rhizobia aisladas fueron capaces de nodular p. Vulgaris y de acuerdo con sus secuencias del gen nodc pertenecen a la biovariedad phaseoli. Las cepas aisladas presentaron los mismos alelos de este gen que cepas americanas de r. Etli y cepas españolas de esta especie y de otras especies próximas a r. Leguminosarum. La efectividad simbiótica de los aislados fue muy variable, alcanzando el 40 % en el más efectivo y bajando del 10% en los tres menos efectivos, tratándose de valores bajos pero acordes con los obtenidos por otros autores. El porcentaje de nitrógeno que deriva de la fijación simbiótica varió entre el 73% y el 13%. En el proceso de selección en microcosmos, dos de las cinco cepas analizadas (oac1020 y vri2090) produjeron un desarrollo significativamente mayor que el testigo sin fertilizar con nitrógeno, con un 22% más de biomasa aérea y un 19% más de rendimiento de grano, si bien el último valor no es significativo desde el punto de vista estadístico.
Datos académicos de la tesis doctoral «Aislamiento, caracterización y selección de rhizobia autóctonos que nodulan habichuela roja (phaseolus vulgaris l.), en la república dominicana«
- Título de la tesis: Aislamiento, caracterización y selección de rhizobia autóctonos que nodulan habichuela roja (phaseolus vulgaris l.), en la república dominicana
- Autor: César Antonio Díaz Alcántara
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 15/07/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Fernando González Andrés
- Tribunal
- Presidente del tribunal: eustoquio Martinez molina
- dulce nombre Rodríguez navarro (vocal)
- paula García fraile (vocal)
- álvaro Peix geldart (vocal)