Tesis doctoral de Juan Pedro De Haro Hernandez
El silenciamiento génico mediado por rna (rna silencing) actúa mediante mecanismos transcripcionales y postranscripcionales para suprimir, de forma específica, la expresión génica de los genes diana. En eucariotas superiores, este mecanismo está implicado en una amplia variedad de procesos biológicos, incluyendo la defensa frente a virus, transposones y transgenes, la regulación de la expresión génica y la formación de la heterocromatina. El control de estos procesos está mediado por pequeñas moléculas de rna, los sirnas y mirnas, que son generados a partir de precursores de rna de doble cadena (dsrna) por la enzima dicer. Estos pequeños rnas son incorporados en complejos multiproteicos donde sirven de guía para identificar moléculas de rna con secuencias complementarias, provocando la inhibición de su transcripción, el bloqueo de su traducción o su degradación. en el hongo cigomiceto mucor circinelloides, la introducción de copias exógenas del gen carb, utilizado como chivato del silenciamiento, conduce a la supresión de la expresión de dicho gen por degradación de su mrna. Los transformantes silenciados acumulan moléculas de sirna, con sentido y antisentido, correspondientes a secuencias del gen carb. Se han identificado dos clases distintas de sirnas antisentido en m. Circinelloides, de 21-nt y 25-nt, que se acumulan diferencialmente durante el crecimiento vegetativo de los transformantes silenciados. La disrupción del gen dicer1 de m. Circinelloides no impide la formación de sirnas en los mutantes dicer1- silenciados. Estos mutantes acumulan los dos tipos de sirnas, de 21 y 25-nt, que se generan cuando se induce el silenciamiento en la estirpe silvestre. Ya que las enzimas dicer son responsables de producir estos sirnas gracias a su actividad rnasaiii, debía existir otro gen que codifique una proteína dicer capaz de generar los sirnas en los mutantes dicer1-. utilizando oligonucleótidos degenerados diseñados a partir de la secuencia de uno de los genes dicer de rhizopus oryzae, un cigomiceto muy próximo filogenéticamente a m. Circinelloides, se consiguió clonar un fragmento del gen dicer2 de este hongo. El rastreo de una genoteca genómica de m. Circinelloides con el fragmento amplificado permitió aislar el gen dicer2 completo y las regiones genómicas adyacentes. Una vez obtenida la secuencia completa del gen se desarrollaron las estrategias conducentes a su caracterización estructural. Mediante experimentos de rt-pcr se pudo determinar la secuencia de poliadenilación y la presencia de cuatro intrones en la secuencia del gen. La proteína dicer-2 que derivaría de la secuencia deducida para el gen dicer2 tendría un tamaño de 1608 aminoácidos y contendría todos los dominios estructurales normalmente encontrados en las proteínas dicer conocidas: un dominio dexdc, un dominio helicasa helicc, un dominio duf283 de unión a rna de doble cadena, un dominio paz, dos dominios rnasaiii y un dominio dsrm (motivo de unión a rna de doble cadena). para completar la caracterización del gen dicer2 se estudió su expresión durante el crecimiento vegetativo de m.Circinelloides mediante un análisis de northern. La comparación de los niveles de expresión del gen dicer2 en individuos silvestres en los que se indujo el silenciamiento del gen carb y en individuos en los que no se llevó a cabo esta inducción no reveló diferencias significativas en cuanto a la expresión de dicho gen en una u otra situación. Este hecho difiere respecto a lo observado en otros organismos, en los que la activación del mecanismo de silenciamiento se asocia a un incremento en los niveles de expresión de los genes implicados en este proceso. para llevar a cabo el análisis funcional del gen dicer2 se obtuvo una estirpe mutante dicer2- mediante disrupción génica. Con el fin de determinar si el mutante dicer2- estaba afectado en la ruta de silenciamiento, se transformó con un plásmido que contiene una repetición invertida correspondiente a una región del gen carb. El procesamiento del rna generado a partir de esta construcción da lugar a una horquilla de dsrna capaz de inducir altas frecuencias de silenciamiento en la estirpe silvestre. Los resultados de la transformación del mutante dicer2- y de la estirpe silvestre revelaron una frecuencia de silenciamiento muy baja en el mutante (5% frente al 84,8 % del silvestre). Sin embargo, la ausencia de proteína dicer-2 parece poder ser compensada en cierta medida por la enzima dicer-1, indicando una redundancia parcial de ambos genes. Además, la producción de los dos tipos de sirnas continúa aún en ausencia de la proteína dicer-2, aunque con muy baja eficacia. Para descartar la existencia de una actividad dicer adicional que explicase la redundancia observada se generó un doble mutante dicer1- dicer2-. Los experimentos de transformación revelaron que esta estirpe es incapaz de llevar a cabo el silenciamiento inducido por transgenes. tras comprobar que es la enzima dicer-2 la que juega el papel principal en el mecanismo de silenciamiento, se llevó a cabo la expresión de un fragmento con los dos dominios rnasaiii en escherichia coli y de la proteína completa en un sistema de células de insecto. Los ensayos enzimáticos realizados con las dos proteínas obtenidas no dieron resultados positivos, probablemente por problemas relacionados con el plegamiento de las proteínas en sistemas heterólogos. en hongos filamentosos existen muy pocos datos acerca de las posibles funciones endógenas del mecanismo de silenciamiento. Para avanzar en el conocimiento de estas funciones, hemos clonado, secuenciado y caracterizado la población de pequeños rnas (srnas) acumulados endógenamente en m. Circinelloides, tanto en la estirpe silvestre como en los mutantes dicer1- y dicer2-. La utilización de métodos de secuenciación masiva y la comparación de las secuencias obtenidas con la secuencia genómica del hongo, recientemente desentrañada, nos ha permitido determinar el alto nivel de transcripción del genoma de mucor, así como la presencia de un elevado número de srnas correspondientes tanto a secuencias repetidas y transposones, como a genes codificadores de proteínas. La comparación de los perfiles genómicos de los srnas acumulados en la estirpe silvestre y en los distintos mutantes de silenciamiento nos ha permitido, además, determinar la ruta de silenciamiento que ha generado cada uno de los srnas y sus características más destacables. Los resultados obtenidos en el análisis genómico y bioinformático de los srnas han sido validados mediante experimentos de northern, que confirman la participación de la maquinaria de silenciamiento en la generación de estos srnas endógenos. A pesar de la redundancia existente entre los dos genes dicer de m. Circinelloides, los resultados indican que la enzima dicer2 es la principal responsable de generar los srnas endógenos en este organismo, existiendo un reducido número de loci para los que la biogénesis de los srnas depende principalmente de dicer1. Así, ambas enzimas mantienen la misma jerarquía que en la ruta de silenciamiento inducida por la introducción de transgenes donde dicer2 juega el papel principal.
Datos académicos de la tesis doctoral «Silenciamiento génico en mucor circinelloides: análisis estructural y funcional del gen dicer-2«
- Título de la tesis: Silenciamiento génico en mucor circinelloides: análisis estructural y funcional del gen dicer-2
- Autor: Juan Pedro De Haro Hernandez
- Universidad: Murcia
- Fecha de lectura de la tesis: 09/09/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Rosa María Ruiz Vazquez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Francisco García carmona
- José María Díaz mínguez (vocal)
- Carlos García estrada (vocal)
- Javier Avalos cordero (vocal)