Tesis doctoral de Eriel Martínez Gutiérrez
Pseudomonas aeruginosa crecida en presencia de ácido oleico, acumula en el sobrenadante de cultivo los derivados oxigenados, ácido 7(s)10(s)-dihidroxi-8(e)-octadecenóico (7,10-dihome) y ácido 10(s)-hidroxi-8(e)-octadecenóico (10-home). Diferentes estudios han demostrado que estas oxilipinas tienen propiedades de interés para la industria y la biomedicina. Sin embargo, tanto el mecanismo de biosíntesis como la función biológica de estos compuestos permanecen sin dilucidar. En este trabajo se estudió el mecanismo catalíticos de la síntesis del ácido 7,10-dihome en p. Aeruginosa. Este compuesto se sintetiza a partir del ácido oleico mediante una actividad diol sintasa descrita por primera vez en bacteria. En un primer paso el intermediario, ácido 10(s)-hidroperoxy-8(e)-octadecenóico (10-hpome) se sintetizó a partir del ácido oleico por una actividad dioxigenasa que incluye la migración del doble enlace desde la posición c8 a c9. Esta actividad es única y hasta la actualidad se desconoce la naturaleza de la enzima que la cataliza. Una segunda actividad transforma el 10-hpome en 7,10-dihome en una reacción hidroperóxido isomerasa. El estudio de la estereoespecífica de esta actividad reveló que utiliza como sustrato solo la configuración s del 10-hpome. Se determinó además el rango de sustrato de la actividad diol sintasa. La enzima reconoce sustratos con un doble enlace en la posición 9 presumiblemente a través del extremo carboxi-terminal. En este sentido se observó una excepción. El ácido vaccénico parece reconocer la enzima mediante el extremo omega-terminal. El producto generado por la actividad diol sintasa sobre el ácido vacccénico fue el ácido 11s,14s-dihydroxi-12(e)-octadecenóico. La actividad diol sintasa se localizó en el periplasma de p. Aeruginosa. A partir del periplasma se realizó una purificación parcial de la enzima lo cual permitió determinar el tamaño aparente de la enzima diol sintasa (~50 kda). Se observó además que las actividades dioxigenasa e hidroperóxido isomerasa permanecían unidas durante todos los pasos de purificación lo cual sugiere que ambas actividades son catalizadas por una sola enzima. La caracterización de la actividad diol sintasa reveló que tiene una actividad máxima a ph 7 y a 37 °c. Por otra parte, el análisis por lc-ms del 7,10-dihome generó una fragmentación atípica. El mecanismo de fragmentación fue dilucidado con la ayuda de isotopómeros. Los resultados obtenidos revelaron que el 7,10-dihome genera una serie de fragmentos que contienen el extremo ¿-terminal en vez del más frecuente carboxi-terminal. Finalmente se identificó el transportador de membrana externa pafadlh. Este transportador participa en la exportación de los ácidos grasos oxigenados formados en el periplasma de p. Aeruginosa por la actividad diol sintasa hacia el medio extracelular donde se acumulan.
Datos académicos de la tesis doctoral «Oxipilinas derivadas del ácido oleico en pseudomonas aeruginosa: biosíntesis, caracterización y transporte.«
- Título de la tesis: Oxipilinas derivadas del ácido oleico en pseudomonas aeruginosa: biosíntesis, caracterización y transporte.
- Autor: Eriel Martínez Gutiérrez
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 14/01/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Á ngels Manresa Presas
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Miguel Regué queralt
- luciano Saso (vocal)
- (vocal)
- (vocal)