Transporte de hierro de larga distancia y metabolómica de la deficiencia de hierro en plantas.

Tesis doctoral de Rubén Rellán álvarez

Iron is an essential element for plants, since it participates in important processes such as chlorophyll synthesis and photosynthetic electron transport. Iron deficiency is one of the major agriculture limiting factors, in spite of being the fourth most abundant element in terrestrial crust. Iron deficiency is induced by a low fe soil bioavailability, especially in calcareous soils. Moreover, fe deficiency can be also associated to metabolic and physiological processes that lead to low fe availability inside the plant. On the other hand, fe can be toxic, since it participates in the production of reactive species of oxygen. Thus, plants must carefully regulate fe acquisition, transport and partitioning within different organ and cell compartments, in order to prevent excess accumulation while obtaining an adequate intake. the elucidation of the molecular identity of metal complexes in plant compartments is still one of the biggest challenges in plant metal transport. In the case of xylem sap, fe is assumed to be transported as complexed forms. Iron xylem loading, transport and unloading studies have mainly used indirect approaches: i) mutants that show an impaired synthesis of putative fe ligands and transporter proteins of ligands or complexes, ii) in silico chemical speciation of fe in plant fluids. These studies proposed different molecules as fe carriers in the xylem: organic acids (e.G., Citric acid), a non-proteinogenic aminoacid like nicotianamine (na) and phytosiderophores (e.G. Mugineic acid). However, there was still no direct determination of fe-complexes with these ligands in plant fluids. Such determinations require the use of analytical techniques that are: i) sensitive, since fe concentrations in plant fluids are usually very low and ii) selective, since plant fluids are complex matrixes. Moreover, the analytical methodologies should maintain the original sample conditions (e.G., Ph), since the fe speciation can be affected. The combined use of highly selective and sensitive molecular (e.G., Esi-ms) and metalspecific (e.G., Icp-ms) mass spectrometry techniques can be used for the determination of metal complexes, especially in plant fluids where direct analysis can be carried out. the most characteristic fe-deficiency symptom in plants is a decrease in chlorophyll levels in young leaves, associated to a reduction in photosynthetic co2 fixation. Iron-deficient plants develop different physiological and biochemical changes to maximize fe mobilization and uptake form the soil. Iron deficiency also causes increases in the root activity of phosphoenolpyruvate carboxylase (pepc) and several enzymes of the glycolytic pathway and the tca cycle. This leads to an anaplerotic root fixation of c, which is then exported as organic acids via xylem to leaves. This may allow maintaining basic processes in fe-deficient leaves, which have otherwise reduced photosynthetic rates. Most of the metabolic changes induced by fe deficiency have been characterized using traditional physiological and biochemical studies, which cover a reduced group of metabolites and/or enzymes. The complete set of metabolites (ca. 250.000 in plants) is the end product of the gen-transcript-protein-metabolite chain, and is called ¿metabolome¿ by analogy with the terms genome and proteome. Metabolomics aims to analyze simultaneously and un-biassedly as much metabolites as possible, and together with genomics, transcriptomics and proteomics has broaden our knowledge of how plants acclimate to different environmental conditions, including abiotic stresses. Although the study of fe deficiency in plants has been tackled by proteomics and genomics approaches, no metabolomics studies had been carried out so far. objectives the general objectives of this thesis are: i) to develop and apply new analytical methodologies for the determination of the fe forms involved in long-distance fe transport in plants, and ii) to study the metabolite profile of plants grown under fe-deficiency conditions. in order to achieve these general objectives the specific objectives are: 1. To study the formation of metal complexes with nicotianamine as affected by ph, ligand and metal exchange by means of electrospray time-of-flight mass spectrometry (esi-tofms). 2. To develop a method for the determination of naturally occurring fe complexes in xylem sap, using high performance liquid chromatography coupled to esi-tofms and inductively coupled plasma mass spectrometry (hplc-esi-tofms and hplc-icp-ms, respectively). 3. To develop an hplc-esi-tofms method for the determination of organic acids in plant tissues. 4. To characterize the changes induced in the metabolite profile of plant roots in response to fe deficiency and resupply, using gas chromatography coupled to mass spectrometry (gc-ms). 5. To characterize the changes induced in the metabolite profile of xylem sap and leaves of plants in response to fe deficiency and resupply, using gc-ms. concluding remarks formation of metal-nicotianamine complexes as affected by ph, ligand exchange with citrate and metal exchange using esi-tofms we showed that fe-na complexes can be determined using esi-tofms. We found that relatively small changes in ph and changes in the concentrations of citrate and metals could have significant effects in na speciation in conditions similar to those present in plant fluids such as xylem and phloem sap. In the xylem sap, na is not likely to complex fe, due to exchange reactions with citrate and other metals, whereas it could chelate other metals such as cu and ni. In the phloem sap, na could still be a good candidate to chelate fe, specially in the fe(ii) form. Our work and other recent studies have shown the feasibility of using esi-ms to study metal-complexes within plant fluids, but some drawbacks inherent to the technique need to be addressed, including: i) the need to maintain as much as possible the ph of the plant compartment under study through the whole extraction, separation and analysis process, ii) the possible changes in metal speciation due to the complex metalligand chemistry, iii) the difficulty to assess the true ph value in solutions which have a considerable amount of organic solvent, and iv) the possibility that metal redox reactions may occur in the esi process. Our work also showed that in silico predictions may fail to accurately speciate na in nonequilibrium solutions such as plant fluids. identification of a tri-iron, tri-citrate complex in tomato xylem sap using an integrated mass spectrometry approach we reported the first direct and unequivocal identification of a natural fe complex in plant xylem sap. a tri-fe(iii), tri-citrate complex (fe3cit3) was found in the xylem sap of fe-deficient solanum lycopersicum mill. Plants resupplied with fe, by using an integrated mass spectrometry approach based on exact molecular mass, isotopic signature and fe determination and chromatographic mobility. This complex was modeled as having an oxo-bridged tri-fe core. A second complex, a di- fe(iii), di-citrate complex was also detected in fe-citrate standards along with fe3cit3, with the fe-tocitrate ratio driving the balance between the two complexes. These results provide evidence for fecitrate complex xylem transport in plants. The consequences for the role of the fe-to-citrate ratio in long-distance fe xylem transport were also discussed. development of an hplc-esi-tofms method to determine organic acids in plant tissue extracts carboxylates are possible candidates for playing a role in fe homeostasis in plants. An hplc-esitofms method was developed to determine organic acids (oxalic, cis-aconitic, 2-oxoglutaric, citric, malic, quinic, ascorbic, shikimic, succinic and fumaric acids) in different plant tissues (xylem sap, leaves and fruit juice) with high selectivity, sensitivity and reproducibility. Quantification was accomplished using 13c isotope-labeled malic and succinic acids as internal standards. Limits of detection were between 0.13 and 255 pmol. The intraday repeatability values were approximately 0.1 and 1.6 % for retention time and peak area, respectively whereas the interday repeatability values were about 0.1 and 4.4%, respectively for retention time and peak area. Good recoveries (90-110%) were obtained for most of the organic acids with the exception of oxalic, 2-oxoglutaric and ascorbic acids in some plant tissues. Due to the importance of carboxylates in cellular metabolism, oxidative stress response and possibly metal speciation, this method may permit to obtain useful information about the plant responses to specific environmental stresses such as fe deficiency and others. changes in the metabolite and protein profiles of sugar beet root tips as affected by fe deficiency and resupply using gc-ms the protein and metabolite profiles of root tips from beta vulgaris plants were found to be affected by fe deficiency and resupply. Two novel and major findings were the increases in dmrl synthase protein concentration and gene expression, and some rfo sugars (e.G., Raffinose and galactinol). these findings give new perspectives to the knowledge of plant responses to fe deficiency. Changes found in glycolysis and tca cycle metabolites and proteins confirmed previous studies. changes in the metabolite profiles of xylem sap and leaves of different plant species in response to fe deficiency and resupply using gc-ms the main changes in the metabolite profile of xylem sap from solanum lycopersicum and lupinus albus in response to fe deficiency were an increase in tca cycle metabolites and a decrease in aminoacids and carbohydrates. The xylem sap metabolite profile of fe-deficient solanum lycopersicum plants becomes similar to that of fe-sufficient controls one day after fe resupply. In solanum lycopersicum and beta vulgaris fe deficient leaves, the main changes in the metabolite profile were the increases in tca cycle metabolites, aminoacids and carbohydrates. A high correlation between selected pairs of aminoacids and tca cycle metabolites suggest that leaves of fe-deficient beta vulgaris plants use aminoacids as a anaplerotic c source. el hierro es un elemento esencial para las plantas ya que participa en importantes procesos metabólicos como la sí­ntesis de clorofila y el trasnporte electrónico en la fotosí­ntesis. La deficiencia de hierro es uno de los principales factores limitantes en la agricultura, a pesar de que este elemento es el cuarto más abundante en la corteza terrestre. La deficiencia de fe es inducida por una baja biodisponibilidad del fe en el suelo, especialmente en los suelos calizos. Además, la deficiencia de fe también puede ser debida a procesos metabólicos y fisiológicos que conducen a una baja disponibilidad de este elemento dentro de la planta. El fe también puede ser tóxico, ya que participa en la producción de especies reactivas de oxí­geno. Por lo tanto, las plantas deben regular cuidadosamente la adquisición de fe, el transporte y su distribución entre los diferentes órganos y compartimentos celulares con el fin de evitar un exceso de dicho elemento y conseguir absorber una cantidad suficiente. la especiación quí­mica de los metales en los diferentes órganos y compartimentos celulares de la planta sigue siendo uno de los mayores retos en el transporte de metales en plantas. En el caso de la savia de xilema, se asume que el fe es transportado en forma de complejo. Los estudios realizados sobre la carga, transporte y descarga de fe en xilema han utilizado principalmente métodos indirectos como: i) el estudio de mutantes que muestran una alteración en la sí­ntesis de posibles ligandos de fe y/o de proteí­nas transportadoras de ligandos o complejos metálicos, ii) la especiación quí­mica in silico del fe en fluidos vegetales. Estos estudios han propuestos diferentes moléculas como ligandos de fe en fluidos vegetales: ácidos orgánicos (ej., Citrato), el aminoácido no proteinogénicos nicotianamina (na) y fitosideróforos (ej., ácido mugineico). Sin embargo, aún no existe una determinación directa de complejos de estos compuestos con fe en fluidos vegetales. Tales determinaciones requieren de técnicas analí­ticas que sean: i) sensibles, ya que las concentraciones de fe en fluidos vegetales suelen ser bajos, ii) selectivas, puesto que los fluidos vegetales son matrices complejas. Además, las metodologí­as de análisis deben preservar las condiciones originales (por ejemplo, el ph) de la muestra ya que los complejos de fe son muy sensibles cambios de algunas de estas condiciones. La utilización combinada de técnicas de espectrometrí­a de masas, altamente selectivas y sensibles con especificidad molecular (ej., Esi-ms) y atómica (por ejemplo, icp-ms) podrí­a resultar muy eficaz en la especiación de metales especialmente en la fluidos vegetales. el sí­ntoma más caracterí­stico de la deficiencia fe es la disminución de los niveles de clorofila en las hojas jóvenes que está asociada a una reducción en la fijación de co2 mediante la fotosí­ntesis. En las plantas deficientes en fe, se producen diferentes cambios fisiológicos y bioquí­micos con el fin de maximizar la movilización y absorción de fe a nivel radicular y su transporte dentro de la planta. La deficiencia de fe también provoca un aumento en la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (pepc) y en varias enzimas de la glicólisis y del ciclo de krebs. Esto lleva a una fijación anaplerótica de c en raí­z, que luego se exporta en forma de ácidos orgánicos a través del xilema a las hojas. Una vez en las hojas, esta fuente de c permitirí­a el mantenimiento de procesos metabólicos básicos en hojas deficientes que tienen bajas tasas fotosintéticas. La mayor parte de los cambios metabólicos inducidos por la deficiencia de fe en plantas, se han caracterizado mediante estudios fisiológicos y bioquí­micos que cubren un reducido grupo de metabolitos y/o enzimas. El conjunto completo de metabolitos (alrededor de 250.000 en plantas) es el producto final de la cadena gen-transcrito-proteí­nametabolito y se denomina metaboloma por analogí­a con los términos genoma y proteoma. La metabolómica pretende analizar de forma no sesgada y simultaneamente tantos metabolitos como sea posible y, junto con la genómica, la transcriptómica y la proteómica, está ampliando nuestro conocimiento de cómo las plantas se aclimatan a diferentes condiciones ambientales, como los estreses abióticos. Aunque el estudio de la deficiencia de fe en las plantas ha sido abordado desde el punto de vista de la proteómica y la genómica, todaví­a no se han llevado a cabo estudios metabolómicos. objetivos los objetivos generales de esta tesis doctoral son: a) desarrollar y aplicar nuevas metodologí­as analí­ticas que permitan la especiación quí­mica del fe en los fluidos vegetales involucrados en el transporte a larga distancia de este elemento en plantas y b) estudiar el perfil de metabolitos de plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de fe. para alcanzar estos objetivos generales se plantean los siguientes objetivos especí­ficos: 1. Estudiar el efecto del ph y las reacciones de intercambio del metal o el ligando sobre la formación de complejos metálicos con nicotianamina mediante espectrometrí­a de masas (ms) con analizador de tiempo de vuelo (tof) y fuente de electrospray (esi). 2. Desarrollar un método que permita la determinación de complejos naturales de fe en plantas involucrados en el transporte de este elemento ví­a xilema mediante cromatografí­a lí­quida de alta resolución (hplc) acoplada a esi-tofms y espectrometrí­a de masas con fuente de plasma de acoplamiento inductivo (icp-ms). 3. Desarrollar un método que permita la determinación de ácidos orgánicos en tejidos vegetales mediante hplc-es-tofms. 4. Caracterizar los cambios en el perfil de metabolitos que se producen en condiciones de deficiencia y reaporte de fe en las raí­ces de las plantas mediante cromatografí­a de gases acoplada a espectrometrí­a de masas (gc-ms). 5. Caracterizar los cambios en el perfil de metabolitos que se producen en condiciones de deficiencia y reaporte de fe en la savia de xilema y las hojas de las plantas mediante gc-ms. principales resultados y discusión formación de complejos metálicos con nicotianamina y efecto sobre los mismos del ph, y de las reacciones de intercambio del metal o el ligando mediante esi-tofms. se ha conseguido determinar los complejos de fe-na mediante esi-tofms. Cambios relativamente pequeños en el ph y en las concentraciones de citrato y metales podrí­an tener efectos significativos en la especiación de na en fluidos vegetales como la savia de xilema y floema. En la savia de xilema, la na no es probable que forme complejos con fe debido a reacciones de intercambio con citrato y con metales, mientras que si podrí­a quelar otros metales como el cu y ni. Sin embargo, en la savia de floema, la na, es un buen candidato para quelar fe, especialmente fe(ii). Este estudio así­ como el de otros investigadores ha demostrado la viabilidad de la técnica de esi-ms para el estudio de complejos metálicos en fluidos vegetales, pero es necesario considerar algunos de los inconvenientes inherentes a la técnica, en concreto: i) la necesidad de mantener, en la medida de lo posible, el ph del fluido vegetal en estudio durante todo el proceso de extracción, separación, y análisis, ii) los posibles cambios en la especiación de los complejos metálicos en estudio, iii) la dificultad para evaluar el verdadero valor de ph en soluciones con una considerable cantidad de disolvente orgánico, y iv) la posibilidad de que ocurran reacciones redox en el proceso de ionización. Además, las predicciones in silico pueden ser inexactas para especiar la na en soluciones que no están en equilibrio, como los fluidos vegetales. identificación de un complejo formado por tres moléculas de citrato y tres átomos de fe en xilema de tomate utilizando espectrometrí­a de masas elemental y molecular se ha logrado por primera vez la identificación directa e inequí­voca de un complejo natural de fe en savia de xilema. El complejo formado por tres moléculas de citrato y tres átomos de fe (fe3cit3) se encontró en la savia del xilema de palntas de solanum lycopersicum deficientes en fe después de haber realizado un reaporte de fe, utilizando un enfoque integrado de espectrometrí­a de masas basado en la determinación de la masa molecular exacta, la firma isotópica y el fe junto con la movilidad cromatográfica. Calculos in silico predicen que el complejo tiene un núcleo formado por tres átomos de fe unidos por un o. Un segundo complejo, formado por dos átomos de fe y dos moléculas de citrato (fe2cit2) también se detectó en soluciones estandar junto con con el fe3cit3. La formación de uno u otro compuesto dependió de la relación fe:citrato. Estos resultados evidencian el papel del citrato en el transporte xilemático de fe. La importancia de la relación fe:citrato en el transporte de fe a larga distancia es discutida. desarrollo de un método de hplc-esi-tofms para determinar ácidos orgánicos en extractos vegetales los carboxilatos son moléculas que pueden tener un papel importantes en la homeostasis de fe en las plantas. Un método de hplc-esi-tofms con alta selectividad, sensibilidad y reproducibilidad fue desarrollado para determinar ácidos orgánicos (oxálico, cis-aconí­tico, 2-oxoglutárico, cí­trico, málico, ácido quí­nico, ascórbico, shikí­mico, succí­nico y fumárico) en diferentes tejidos vegetales (savia de xilema, hojas y jugo de frutas). La cuantificación se realiza mediante la utilización como patrones internos de ácidos málico y succí­nico marcados isotópicamente con 13c. Los lí­mites de detección fueron entre 0.13 y 255 pmol. Los valores de repetibilidad fueron aproximadamente 0.1 y 1.6% para el tiempo de retención y área del pico, respectivamente, mientras que los valores de reproducibilidad estuvieron entre 0.1 y 4.4%, respectivamente, para el tiempo de retención y el área del pico. Los porcentajes de recuperación fueron aceptables (90-110%) para la mayorí­a de los ácidos orgánicos, con la excepción del ácido oxálico, 2-oxoglutárico y ascórbico en alguno de los tejidos. Debido a la importancia de los ácidos orgánicos en el metabolismo celular y en la respuesta al estrés oxidativo y posiblemente en la especiación de metales este método puede ser aplicado para obtener información sobre la respuesta de la planta a estreses ambientales especí­ficos como la deficiencia de fe entre otros. estudio de los cambios en los perfiles de metabolitos y proteí­nas de raí­z beta vulgaris afectadas por deficiencia y reaporte de fe. los perfiles de proteí­nas y metabolitos de puntas de raí­z de plantas de beta vulgaris fueron afectados por la deficiencia y reaporte de fe. Los cambios más relevantes fueron el incremento de i) la dmrl sintetasa tanto a nivel de proteí­nas como de expresión génica y ii) algunos azúcares de la familia de la rafinosa (ej., Rafinosa y galactinol). Estos hallazgo no habí­an sido descrito hasta ahora en plantas deficientes en fe y por consiguiente abren nuevas ví­as de estudio de este desorden nutricional. cambios en la glucólisis y el ciclo de krebs fueron también encontrados confirmando estudios previos. estudio de los cambios en los perfiles de metabolitos de la savia de xilema y de las hojas de diferentes especies de plantas en respuesta a la deficiencia y reaporte de fe. los principales cambios en los perfiles de metabolitos de la savia del xilema de solanum lycopersicum y lupinus albus en respuesta a la deficiencia de fe fueron un aumento en los metabolitos del ciclo de krebs y una disminución general de aminoácidos y carbohidratos. El perfil de los metabolitos de la savia de xilema de las plantas de solanum lycopersicum con deficiencia de fe se acerca al de las plantas control en tan solo 24h después de un reaporte de fe. En hojas deficiente en fe de solanum lycopersicum y beta vulgaris los principales cambios en el perfil metabólico fueron los aumentos en los metabolitos del ciclo de krebs, aminoácidos y carbohidratos. Correlaciones elevadas entre aminoácidos y ácidos orgánicos del ciclo de krebs sugieren que en las hojas de plantas de beta vulgaris deficientes en fe se producen reacciones anapleróticas que utilizan aminoácidos como fuente de c.!

Datos académicos de la tesis doctoral «Transporte de hierro de larga distancia y metabolómica de la deficiencia de hierro en plantas.«

• Título de la tesis:  Transporte de hierro de larga distancia y metabolómica de la deficiencia de hierro en plantas.
• Autor:  Rubén Rellán álvarez
• Universidad:  Autónoma de Madrid
• Fecha de lectura de la tesis:  11/02/2011

Dirección y tribunal

• Director de la tesis
  • Javier Abadia Bayona
• Tribunal
  • Presidente del tribunal: ildefonso Bonilla mangas
  • robert Hider (vocal)
  • cathy Curie (vocal)
  • julia Kehr (vocal)