Tesis doctoral de Francisco Jose Roig Molina
La especie v. Vulnificus es una de las especies del género vibrio cuyo genoma ya ha sido secuenciado en algunas cepas. Las dos cepas secuenciadas, y completamente anotadas, hasta el momento del inicio de la escritura de la presente tesis doctoral, muestran un alto grado de similitud en sus genomas, difiriendo principalmente en el contenido plasmídico. Esta similitud no refleja el alto grado de plasticidad genética que debería mostrar una especie capaz de actuar como organismo de vida libre, como miembro de la microbiota comensal y como agente patógeno, colonizando anfitriones tan diferentes como seres humanos y peces. Es posible que esta similitud sea solo aparente, ya que los dos aislados estudiados son del mismo biotipo (biotipo 1) y ambos se habían obtenido de sangre humana. Dada la imposibilidad, al inicio de la presente tesis doctoral, de secuenciar los genomas de representantes de los distintos estilos de vida de v. Vulnificus, la estrategia que hemos utilizado para el análisis de la diversidad genética de la especie ha sido comparar, mediante hibridación substractiva, los genomas de cepas seleccionadas por sus características diferenciales (virulencia/no virulencia ambiental/clínica…) Y estudiar la presencia de las secuencias encontradas en una colección de cepas representativa de la diversidad genética de la especie, ya que está formada por más de 100 cepas de los tres biotipos aisladas de todo el mundo, tanto del ambiente como de muestras clínicas humanas y de animales, durante un periodo de más de 30 años. los resultados obtenidos a lo largo de los distintos capítulos de muestran que v. Vulnificus es una especie más variable genéticamente que lo que se deduciría a partir de la comparación de los genomas publicados. Así, en el primer capítulo demostramos que la variabilidad intraespecífica de v. Vulnificus es de hasta un 12%. Este porcentaje es solo comparable al encontrado en otras bacterias patógenas como neisseria meningitidis, que puede alcanzar el 7-10% (jordan y cols., 2002). no hemos encontrado ningún gen que pueda considerarse como marcador de virulencia para humanos mediante comparación de genomas entre cepas virulentas para humanos y no virulentas y la posterior búsqueda por pcr de las secuencias seleccionadas en nuestra colección de cepas. Sí que hemos detectado polimorfismos que pueden estar relacionados con patogenicidad, en particular, los que afectan a los genes rtxa, ktra y pmeompa-like. El gen rtxa mostró una variabilidad relacionada con el biotipo que ha sido analizada en profundidad en la presente tesis doctoral. En lo que respecta a los genes ktra y pmeompa-like las cepas quedaron distribuidas en dos grupos en base a su variabilidad: cepas clínicas de biotipo 1 por un lado y el resto por otro, en el primer caso, y aislados con potencial patógeno para humanos, independientemente de su biotipo, y el resto por otro, en el segundo caso. Si estos dos genes son o no genes de virulencia queda por demostrar en posteriores estudios. además, encontramos secuencias sin similitud con secuencias conocidas que también presentaron una distribución diferencial entre e intrabiotipos. Estas secuencias se pueden clasificar en tres grupos: secuencias específicas de biotipo 2, todas ellas plasmídicas, secuencias específicas de biotipo 2 serovariedad e, y secuencias específicas de biotipo 2 serovariedad e y biotipo 3. es probable que el conjunto de secuencias de distribución diferencial entre biotipos y serovariedades haya tenido algún papel en la divergencia evolutiva de v. Vulnificus. Esta distribución diferencial puede explicarse por captación independiente de las mismas por representantes del biotipo 2 o evolución del biotipo 2 a partir de cepas de biotipo 1 que captaron determinadas secuencias. Respecto al biotipo 3, la teoría generalmente aceptada es que se trata de un híbrido entre el biotipo 1 y el 2. Sin embargo, los datos obtenidos en este trabajo, al igual que en otros trabajos (cohen y cols., 2007; bisharat y cols., 2007b; sanjuan y cols., 2011), muestran que se encuentra más próximo al biotipo 2 que al 1. Otro problema que se plantea a la luz de los datos obtenidos es la aparición de los distintos serotipos dentro del biotipo 2, ya que éstos no podrían aparecer por un fenómeno de evolución secuencial desde un solo clon, sino como resultado de fenómenos independientes de adquisición de secuencias por parte de cepas diferentes de biotipo 1, lo que supondría un origen polifilético, siendo una de las secuencias captadas el plásmido de virulencia, que es específico de biotipo 2 (lee y cols., 2008). el estudio en profundidad de los plásmidos revela que la mayoría de las cepas de v. Vulnificus poseen plásmidos, especialmente las cepas pertenecientes a los biotipos 2 y 3, en los que los plásmidos se encuentran presentes en todos los aislados. En el biotipo 1 los plásmidos no están tan ampliamente distribuidos, datos que son concordantes con estudios previos (davidson y oliver, 1986). Las cepas estudiadas presentan 29 perfiles plasmídicos diferentes que, pese a no mostrar relación entre perfiles y origen, muestran especificidad de biotipo/serovariedad. de todos los plásmidos encontrados, dos de ellos destacan por su amplia distribución: el plásmido de virulencia para peces de 68-70 kb y un plásmido conjugativo de la familia de plásmidos-f de 48-56 kb. Hemos encontrado un gen en el plásmido de virulencia, el gen vep07, el cual no muestra similitud significativa con ningún gen conocido (lee y cols., 2008) que resulta un candidato a gen de virulencia dado que mutantes naturales deficientes en este gen no son virulentos para peces. De hecho, este gen no muestra variabilidad en las cepas virulentas analizadas lo que demuestra que está sometido a presión de selección. el plásmido conjugativo está presente en el 90% de las cepas de biotipo 2, en el 100% de las de biotipo 3 y en todos los aislados portadores de plásmidos de biotipo 1. la presencia casi generalizada de los plásmidos en v. Vulnificus sugiere que los elementos extracromosómicos han tenido un papel muy importante en la evolución de esta especie. De hecho, el plásmido de virulencia codifica para un sistema de resistencia a la inmunidad innata de la anguila que permite a la bacteria que lo posee colonizar y sobrevivir en un nuevo hábitat (valiente y cols., 2008; lee y cols., 2008b). El plásmido conjugativo, por su parte, puede contribuir a la movilización de genes entre cepas favoreciendo la variabilidad genética de la especie. De hecho, se ha demostrado que el plásmido de virulencia se transmite entre cepas por conjugación, cointegrado con el plásmido conjugativo (lee y cols., 2008). la comparación entre genomas y tipado plasmídico se examinó mediante el análisis de patrones de ribotipado frente a perfiles de plásmidos, no mostrando correspondencia entre ambos para el biotipo 1 y 2, pero sí para el biotipo 3. Estos datos son concordantes con el origen polifilético de los biotipos 1 y 2 propuesto para la especie (sanjuan, 2008) y está apoyado por los datos derivados de la hibridación substractiva realizada en esta tesis. Asimismo, los datos del biotipo 3 son congruentes con la hipótesis de que el biotipo 3 está formado por un solo grupo clonal (bisharat y cols., 2007a). la presencia de múltiples plásmidos en la especie plantea la cuestión de si alguno de ellos es un plásmido de resistencia a antibióticos (plásmidos r). Para averiguarlo, realizamos pruebas de sensibilidad a diferentes antibióticos con una amplia colección de cepas de todos los biotipos y serovariedades. Los antibióticos se seleccionaron siguiendo un doble criterio, que se usaran contra vibrionáceas y que la resistencia al antibiótico estuviera descrita como plasmídica. No encontramos relación entre perfil plasmídico y perfil de resistencias no tratándose, por tanto, de resistencias plasmídicas asimismo no se encontró relación entre perfil de resistencia y origen, lugar aislamiento, biotipo o serovariedad del aislado. los datos obtenidos, pese a no poder encontrar una relación directa con ninguna de las variables estudiadas, fueron interesantes. Un alto porcentaje de cepas de los tres biotipos fueron resistentes a uno o más antibióticos, con porcentajes similares a los descritos en aislados ambientales y clínicos humanos de asia y norte américa (radu y cols., 1998; zanetti y cols., 2001; baker-austin y cols., 2009). Pero, a diferencia de otros trabajos, el presente trabajo muestra una concentración de cepas multirresistentes en aislados derivados de piscifactorías, hecho que sugiere que la resistencia a antibióticos en v. Vulnificus, especialmente a quinolonas, podría estar relacionada con la contaminación urbana y con el uso inadecuado de estos fármacos en la terapéutica animal (young, 1993; goñi-urriza y cols., 2000; biyela y cols., 2004) y, en este caso, especialmente en la terapéutica en piscicultura. entre los antibióticos de elección en terapia humana y animal de la vibriosis pertenecen a la familia de las quinolonas (samuelsen y lunestad, 1996b; samuelsen y bergh, 2004; grave y cols., 2008; centers for disease control and prevention, 2009). Encontrando un número relativamente alto de cepas resistentes a quinolonas entre aislados de piscifactoría y comprobando en el laboratorio que la mutación bajo presión de selección se produce de manera relativamente fácil por lo que pasamos a estudiar los genes que codifican para las dianas de las quinolonas, adn girasa (gyra y gyrb) y topoismerasa tipo iv (parc y pare) y, en especial, unas regiones de los mismos denominadas qrdr (regiones determinantes de resistencia a quinolonas) (okuda y cols., 1999a; okuda y cols., 2006; colquhoun y cols., 2007; rodkhum y cols., 2008) en cepas resistentes naturales, cepas sensibles y los mutantes resistentes obtenidos en el laboratorio. en v. Vulnificus, las mutaciones halladas en el gen gyra son concordantes con los resultados obtenidos para otras bacterias en estudios anteriores (okuda y cols., 1999a; okuda y cols., 1999c), mostrando en todos los aislados resistentes a quinolonas un cambio en el aminoácido 83, salvo en uno que tiene un cambio en el aminoácido 82. Para el gen gyrb, sólo hay descritas dos mutaciones que conlleven a la resistencia a quinolonas, pero éstas no coinciden con las halladas en nuestras cepas. En el caso del gen parc de v. Vulnificus, el gen mutado presenta sustituciones en el aminoácido 85 (serina por isoleucina) cercano al aminoácido 80, definido como un punto importante para la resistencia a quinolonas (vila y cols., 1996; heisig, 1996; mouneimne y cols., 1999; okuda y cols., 1999a; akasaka y cols., 2001). Las mutaciones en esta zona, cambian la carga electromagnética volviendo la zona hidrofóbica, lo que favorecería la resistencia. Ninguna de las cepas estudiadas presenta mutaciones en el gen pare. estos resultados sugieren que una mutación puntual en el gen gyra puede conferir resistencia al ácido nalidíxico en v. Vulnificus. Además las cepas que presentan una mutación en el gen parc presentan una mayor resistencia a las quinolonas y también a las fluorquinolonas. el análisis por hibridación sustractiva reveló que el gen rtxa de v. Vulnificus mostraba una gran variabilidad entre biotipos, resultado posteriormente confirmado por otros estudios (satchell, 2007; lee y cols., 2008b). La toxina rtx de v. Vulnificus pertenece a la familia de las martx (multifunctional autoprocessing repeat-in-toxin, toxinas autoprocesantes multifuncionales con secuencias repetitivas). Estas toxinas se pueden dividir en tres partes claramente diferentes, los extremos n y c terminal (que contienen las secuencias repetitivas) y una región interna que contiene los distintos dominios funcionales. Los extremos n y c terminal son altamente conservados, tanto dentro de la especie como dentro del género, resultado que es concordante con la función propuesta para estas regiones, que es la de interactuar con la membrana de las células eucarióticas permitiendo la translocación de los dominios funcionales al citoplasma. Entre los dominios funcionales destaca el dominio cpd, cuya función es la escisión de la parte interna (autoprocessing) de la proteína permitiendo la función del resto de dominios (sheahan y cols., 2007). En total hemos estudiado 8 dominios diferentes, varios de ellos han sido redefinidos en este trabajo en función de su similitud con otras secuencias conocidas. V. Vulnificus produce tres tipos distintos de martx; los aislados de biotipo 1 muestran dos tipos diferentes de martxvv, el i y el ii; todos los aislados de biotipo 2 presentan el tipo iii y el biotipo 3 presenta el tipo ii. El tipo i coincide con el descrito por satchell (2007); el tipo ii, descrito en este trabajo por primera vez, se diferencia del tipo i por carecer de uno de los dominios (el dominio rtxa pa) y el tipo iii coincide con el tipo descrito por lee y cols. (2008b) en el plásmido de virulencia del biotipo 2. En este trabajo también hemos encontrado que la copia cromosómica del gen rtxa, en las cepas de biotipo 2, es idéntica a la plasmídica y que el biotipo 3 presenta la martxvv tipo ii. la martxvv es uno de los principales factores de virulencia de v. Vulnificus para humanos, ya que mutaciones en este gen eliminan prácticamente la virulencia para ratones (kim y cols., 2008; lee y cols., 2008a). Las martxvv tipo i y ii han sido ambas detectadas en aislados humanos, y siendo el tipo ii carente del dominio rtxa pa, sugiere que este dominio no es esencial en la virulencia para humanos. Los aislados de biotipo 2 (patógenos de peces) muestran la martxvv tipo iii, que podría estar relacionado con la virulencia específica para los peces. El papel de los distintos tipos de martxvv en virulencia, así como la razón de la duplicación del gen en el biotipo 2 está todavía por dilucidar. el estudio evolutivo de las secuencias de los distintos genes muestra que son mosaicos de fragmentos con diferentes historias evolutivas, lo que se puede ver de manera clara al no ser comparables las historias evolutivas de los genes completos y de los distintos fragmentos. Ninguna de las historias evolutivas obtenidas es equivalente al hipotético escenario evolutivo de la especie (cohen y cols., 2007; bisharat y cols., 2007b). Por ejemplo, el árbol filogenético obtenido con el gen completo muestra un escenario evolutivo poco verosímil a nivel específico, en el que v. Vulnificus forma un grupo compacto con l. Anguillarum y v. Splendidus (ambas íntimamente relacionadas con la cepa riu-1), apareciendo v. Cholerae como un grupo monofilético bien sostenido. Esta situación puede ser explicada fácilmente si el gen, en realidad, es un gen mosaico y, por tanto, se mezclan en él historias evolutivas diferentes. este resultado que muestra a estos genes como mosaicos de fragmentos, es concordante con la pertenencia de los genes martx a la familia de genes «segmentados», genes que presentan regiones de secuencia variable intercalada con zonas de secuencia constante. la explicación más probable para esta compleja historia evolutiva sería que, los diferentes dominios han sido adquiridos por fenómenos de tgh y posterior recombinación, dando lugar a nuevas combinaciones, que podrían haber sido favorecidas por selección. El análisis bioinformático de las secuencias de los dominios revela que ha habido, al menos, dos eventos de tgh que han afectado a los dominios a/b hidrolasa y cpd y que, probablemente, ha habido un tercer evento afectando al dominio efa/lifa. el caso de las martx puede ser un ejemplo de fenómeno evolutivo mediado por plásmidos puesto que la toxina martxvv tipo iii, la del biotipo 2, está codificada por duplicado en el cromosoma y en el plásmido. Esta situación podría ser explicada por la adquisición de distintos genes mediados y que posteriormente sufrieron fenómenos de recombinación llegando a la situación actual. muchos investigadores han destinado sus esfuerzos a la búsqueda de un sistema que permitiera discriminar de forma rápida y fiable, los aislados clínicos de los ambientales diversos sistemas han sido propuestos para este fin pero ninguno de ellos conseguía una eficiencia del 100%, fallando sobre todo en los aislados de biotipos 2 y 3 (sanjuan y cols., 2009). Basándonos en un trabajo previo (sanjuan, 2008), en el que se vio la utilidad potencial del gen pilf, intentamos poner a punto una metodología basada en la pcr que fuera útil para discriminar los aislados potencialmente patógenos para los humanos. El análisis de la secuencia completa de este gen en numerosas cepas, utilizando el método «neighborn-joining», mostró una clara separación en grupos de las cepas; uno de ellos englobaba a todos los aislados potencialmente patógenos para humanos y otro agrupaba al resto de cepas. El análisis de esas secuencias mediante el alineamiento de las mismas puso de manifiesto un región polimórfica de 34 nucleótidos, a partir de la cual se pudo diseñar una pcr múltiple que permite diferenciar con una eficiencia de100% aquellas cepas de v. Vulnificus potencialmente peligrosas para la salud pública (vvpdh+) de las que no lo son (vvpdh-). Asimismo, corroboramos que la cepa cect529t, pese a estar aislada de sangre, no resiste al suero humano, confirmando así lo expuesto por otros autores. (Amako y cols., 1984) y su inclusión en los grupos ambientales por otros estudios (sanjuan y cols., 2009). Igualmente se constató la importancia de la cápsula para la supervivencia al suero humano (wright y cols., 1990; amaro y cols., 1994; linkous y oliver, 1999; strom y paranjpye, 2000). la utilización de esta pcr de forma rutinaria en la industria alimentaria para el estudio de lotes de ostras es factible, ya que se puede realizar la pcr a partir de líquido intravalvar de modo directo, obteniendo un límite de detección de 4 x 102 ufc/ml. por último, se probó la viabilidad del uso de técnicas de tipificación por pcr, para agrupar los distintos aislados en serotipos, en base a los perfiles obtenidos (pacheco y cols., 1997; albufera y cols., 2009; ishii y sadowsky, 2009). El sistema gtg5-pcr en condiciones restrictivas proporciona perfiles correlacionados con pertenencia de las cepas a las distintas serovariedades, proporcionando una correspondencia del 100% entre perfil y serovariedad, tanto para las cepas de biotipo 2 y 3 (serovariedades o [biotipo 3], a, e e i [biotipo 2]) como para las cepas de biotipo 1, serotipadas con el sistema de inmunotinción del antígeno o (serovariedades t, f, w y m) que muestran un perfil diferente para cada una de ellas. además basándonos en lo expuesto por otros autores, este tipo de sistemas permite diferenciar grupos clonales e identificar grupos genéticamente cercanos (vos y cols., 1999; dabo y cols., 1999), con lo cual este sistema nos permitiría, además de diferenciar serogrupos en v. Vulnificus, también diferenciar grupos clonales. Estos datos nos llevan de nuevo a plantear la hipótesis del origen polifilético de los biotipos 1 y 2, ya que esos biotipos aparecen formados por diversos grupos clonales.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio genómico sobre el patógeno vibrio vulnificus«
- Título de la tesis: Estudio genómico sobre el patógeno vibrio vulnificus
- Autor: Francisco Jose Roig Molina
- Universidad: Universitat de valéncia (estudi general)
- Fecha de lectura de la tesis: 03/06/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Carmen Amaro González
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Jesús angel López romalde
- José Rafael Penades casanova (vocal)
- Ana margarida Trigo de sousa roque (vocal)
- Fernando Gonzalez candelas (vocal)