Tesis doctoral de Consuelo Martinez Redondo
La antitrombina es una proteína que pertenece a la familia de las serpinas. Es el anticoagulante endógeno más potente y su deficiencia predispone a la aparición de eventos trombóticos, especialmente en territorio venoso. Clásicamente la deficiencia congénita de antitrombina se ha clasificado en dos tipos: el tipo i, caracterizado por un déficit cuantitativo de antitrombina, en el que el alelo mutado no se traduce en ninguna proteína, y el tipo ii, que se define por la presencia en el plasma de una forma mutada de la proteína con función anticoagulante significativamente alterada. Su diagnóstico se basa en pruebas funcionales que miden la actividad anti-factor x activado en plasma y en métodos antigénicos (agat) que miden la cantidad de proteína en plasma. Sin embargo, el análisis molecular no se realiza de forma rutinaria. El gen de la antitrombina (serpinc1) se localiza en el brazo largo del cromosoma 1 (q23-q25.1) y está compuesto por siete exones. Hasta el momento se han descrito 235 mutaciones diferentes en este gen asociadas a deficiencia congénita de antitrombina (human gene mutation database, hgmd¿). nuestro grupo de investigación es centro de referencia para el estudio molecular del gen serpinc1 en pacientes con deficiencia de antitrombina, contando con una de las series más largas de deficiencias de antitrombina, estudiadas en un único centro, de las descritas hasta ahora en la literatura. objetivos el objetivo principal de este trabajo de tesis doctoral es realizar la caracterización molecular de la deficiencia congénita de antitrombina, correlacionando dichos resultados con las características clínicas y funcionales. Como objetivo secundario se plantea elaborar un protocolo de estudio molecular del gen serpinc1 en pacientes con sospecha de deficiencia de antitrombina. material y métodos se ha estudiado un total de 119 muestras con sospecha de deficiencia congénita de antitrombina, remitidas por diferentes hospitales españoles, de portugal e israel. Inicialmente se ha confirmado el diagnóstico de deficiencia de antitrombina mediante la determinación de la actividad anti-fxa plasmática por métodos cromogénicos, y de los niveles plasmáticos de agat por método inmunológico, aceptando finalmente para el estudio de mutaciones 87 muestras. El estudio molecular se ha realizado en las muestras de adn genómico de los pacientes, mediante amplificación por pcr de los siete exones del gen serpinc1 y posterior secuenciación de cada exón y sus regiones intrónicas flanqueantes, mediante un sistema de electroforesis capilar (applied biosystems 3130xl), abordando inicialmente los exones de mayor tamaño. Cada mutación encontrada se ha confirmado realizando una nueva amplificación y secuenciación del exón afectado y, en los casos en que ha sido posible, se ha realizado el estudio en otros miembros afectos de la familia. La detección de grandes deleciones se ha realizado mediante la técnica de mlpa. El estudio se ha completado mediante determinación de otras alteraciones protrombóticas congénitas (factor v leiden, protrombina g20210a, déficit de proteína c y proteína s). resultados y discusión de las 87 muestras estudiadas, 67 presentaban una deficiencia clásica de antitrombina (<70% de actividad anti-fxa), de las cuales 40 eran tipo i y 27 eran tipo ii. Veinte casos presentaban una deficiencia moderada (70-90% de actividad anti-fxa) con historia personal o familiar que sugería alguna alteración en la antitrombina. De este último grupo se ha identificado la mutación responsable de la deficiencia en 4 casos, siendo en todos ellos la mutación a384s (antitrombina cambridge ii). En el grupo de deficiencias clásicas, se ha identificado la mutación responsable en 66 casos, de los cuales 38 presentaban mutaciones ya descritas previamente en la literatura (22 mutaciones diferentes) y 28 casos presentaban mutaciones nuevas no descritas previamente (26 mutaciones diferentes). Once casos mostraban además alguna otra alteración protrombótica congénita, mostrando una tendencia a la presentación de eventos trombóticos más severos y a edades más tempranas. en cuanto al tipo de mutación identificada, las que provocan un cambio de sentido son las más frecuentes. La consecuencia del cambio de aminoácido depende del residuo afectado, su relevancia funcional y estructural, de modo que aquellos que afectan a residuos localizados en dominios funcionalmente relevantes (dominio de unión a heparina, centro reactivo o la hebra c) suelen asociarse a deficiencias tipo ii. Mientras, los cambios que afectan a residuos conservados en la familia de las serpinas o localizados en regiones relevantes para la movilidad de la molécula, pueden tener consecuencias conformacionales que impiden el correcto plegamiento de la proteína, inducen la formación de oligómeros e impiden su secreción, dando lugar a deficiencias con fenotipo de tipo i. Aquellas mutaciones que provocan la aparición de un codón de parada prematuro se asocian invariablemente con deficiencias tipo i. Hemos descrito el primer caso conocido de mutación compleja, sin cambio en la pauta de lectura, asociada a deficiencia tipo ii. En dos casos con deficiencia moderada de antitrombina no se ha identificado ninguna mutación en el gen serpinc1, pero los estudios bioquímicos realizados posteriormente sugieren la existencia de alteraciones en otros genes implicados en el procesamiento post-traduccional de la proteína. en solamente 1 caso con deficiencia clásica de antitrombina no se ha identificado ninguna mutación. El protocolo propuesto de estudio de mutaciones en el gen serpinc1 consigue identificar la mutación responsable en el 98.6% de casos con deficiencia de antitrombina con un coste por determinación bajo. conclusión el estudio molecular del gen serpinc1 en pacientes con deficiencia de antitrombina permite la identificación de nuevas mutaciones y contribuye a identificar nuevos mecanismos implicados en la deficiencia de este potente anticoagulante, alguno de los cuales puede extrapolarse al resto de serpinas. doctorando dña. Consuelo martínez redondo. Licenciada en medicina. Médico especialista en hematología y hemoterapia. directores del proyecto de tesis – dr. Javier corral de la calle. Profesor contratado doctor del departamento de medicina interna de la universidad de murcia. – dra. Ana isabel antón garcía. Doctora del grupo de hematología y oncología experimental del departamento de medicina interna de la universidad de murcia. – dra. Irene martínez martínez. . Doctora del grupo de hematología y oncología experimental del departamento de medicina interna de la universidad de murcia.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio molecular de la deficiencia congénita de antitrombina«
- Título de la tesis: Estudio molecular de la deficiencia congénita de antitrombina
- Autor: Consuelo Martinez Redondo
- Universidad: Murcia
- Fecha de lectura de la tesis: 30/06/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Ana Isabel Anton Garcia
- Tribunal
- Presidente del tribunal: vicente Vicente garcia
- rogelio Gonzalez sarmiento (vocal)
- jordi Fontcuberta boj (vocal)
- María fernanda López fernández (vocal)