Tesis doctoral de David Sardon Ruiz
La hematuria enzoótica bovina (heb) es una enfermedad neoplásica que afecta al ganado vacuno y que se debe a una intoxicación crónica por la ingestión de heléchos (pteridium spp.). Los animales expuestos de forma reiterada al consumo de heléchos desarrollan lesiones tumorales en la vejiga de la orina. Se desconoce la importancia de la heb en nuestro país, así como diversos aspectos de la enfermedad, sobre todo en etapas tempranas de la misma, antes de que aparezcan los tumores vesicales. En esta tesis doctoral se ha llevado a cabo un estudio de preValencia de lesiones de vejiga de la orina en ganado vacuno adulto en extensivo sacrificado en matadero y estudios histológicos, inmunohistoquímicos y moleculares de lesiones vesicales de ganado bovino relacionadas con la ingesta continuada de heléchos. para conocer la preValencia de lesiones en la vejiga de la orina en matadero y su relación con el consumo de heléchos, se llevó a cabo la sección y observación de la mucosa de todo el ganado bovino adulto en explotación extensiva sacrificado en el matadero de bilbao (zorroza) durante un año (de abril de 2002 a abril de 2003), (n=126) obteniéndose muestras de las vejigas lesionadas para posteriores análisis (n=46). Se incluyeron, asimismo, vejigas de la orina de vacas necropsiadas pertenecientes a una explotación con hematuria enzoótica bovina endémica (plaséncia, cí ceres, explotación a). Se tomaron muestras de orina a vacas adultas de la explotación a (n=66; media de edad=8,8 años, min-max=2-16) y de otra granja afectada de heb en los molinos (Madrid, explotación b) (n=54; media de edad=7,2 años, min-max= 2-14) para el estudio de citologías urinarias a partir del sedimento urinario mediante la tinción de may-grí¼mwald-giemsa, siguiendo la metodología general descrita para animales domésticos. Se tomaron muestras de sangre a 42 animales adultos de la explotación a para la determinación de los niveles séricos de factor de necrosis tumoral-a (tnf-a) mediante la técnica de elisa (human tnf-a elisa, versión 3, blk internacional). Se emplearon muestras de sangre (n=10) y orina (n=4) de vacas sanas como controles para el estudio citológico y sérico de tnf-a. se realizó un estudio macroscópico e histológico en un total de 56 vejigas de la orina (matadero de bilbao -50-; explotación a, -6-). Se incluyeron 4 vejigas de la orina normales de ganado vacuno adulto obtenidas procedentes también del matadero de bilbao, como controles. Las muestras se procesaron para el estudio histológico siguiendo métodos rutinarios y se tiñeron con h/e. Se valoró en la mucosa el número de capas y aspecto de las células del epitelio de transición, (células normales, displásicas o tumorales). En la lámina propia se analizó la presencia o ausencia de edema, congestión, fibrosis, células inflamatorias, dilatación de vasos linfáticos, hemorragias, así como el aumento de los capilares subepiteliales. Mediante la técnica inmunohistoquímica de streptavidina-biotina-peroxidasa, se analizó la inmunoexpresión de h-ras (n=56), p53 (n=56), papilomavirus bovino tipo 1 (n=56), tnf-o-(n=60) y ki-67 (n=56). Se incluyeron 4 vejigas bovinas normales como controles. La inmunoexpresión de h-ras, ki-67 y p53 también se valoró en citologías urinarias fijadas en acetona (n=123). El recuento de células positivas (h-ras, ki-67 y p53) se realizó empleando un microscopio olympus bx 50 adosado a un ordenador provisto de un analizador de imágenes (micro image versión 4.0 para windows 98) con el que se valoraban en cada caso tres campos representativos (20x). el estudio molecular se centró en el gen h-ras, en la presencia de papilomavirus bovino y en la técnica differential display. De acuerdo con la bibliografía consultada, se analizó mediante pcr la presencia de mutaciones en el exón 2 del gen h-ras en 13 muestras de vejiga de la orina seleccionadas tras el estudio anatomopatológico e inmunohistoquímico y conservadas en rnaiater. Para el análisis molecular mediante pcr de papilomavirus bovino se analizó la presencia de mutaciones en un fragmento de 307 pares de bases que incluía la secuencia de la proteína e5 de bpv-1 y bpv-2 y en una región de control, denominada «long control región» (lcr) de 250 pares de bases de bpv-1 y bpv-2, que es la encargada de controlar la expresión de los genes e6 y e7. Para ello, se seleccionaron 36 muestras de vejigas de la orina previamente caracterizadas mediante el estudio anatomopatológico e inmunohistoquímico y conservadas en rnaiater. En ambos casos se utilizó una vejiga bovina normal como control negativo. La técnica de differential display se realizó sobre 6 vejigas preservadas en rnaiater y seleccionadas tras el estudio histopatológico (explotación a -3-; matadero de bilbao -3-). la asociación estadística de los datos histopatológicos e inmunohistoquímicos fue estudiada con software spss (versión 11.5) en el centro de proceso de datos de la ucm. Se consideraron significativos valores de p< 0,05. el estudio de preValencia en matadero reveló la presencia de alteraciones macroscópicas en un 36,5% (46/126) del total de muestras inspeccionadas (43/46 cistitis crónicas y 3/46 procesos tumorales). Todos los animales con lesiones vesicales procedían de explotaciones extensivas con riesgo de intoxicación crónica por heléchos (extremadura). Dada la ausencia de alteraciones externas en las vejigas afectadas, se propone la sección de la vejiga de la orina como protocolo de inspección rutinario en mataderos en el ganado vacuno adulto procedente de zonas de riesgo. en total (matadero y explotación a) se diagnosticaron histológicamente 44 cistitis crónicas y 8 tumores. El estudio histopatológico de las cistitis crónicas, mostró un incremento del número de capas del epitelio (47,7%) y cambios displásicos en el epitelio de transición (20,4%). En la lámina propia se observó la presencia de edema (13,6%), linfangiectasias (56,8%), incremento de capilares subepiteliales (93,2%) y presencia de infiltrado linfocitario multifocal (70,4%) y difuso (15,9%). Los 8 tumores analizados fueron diagnosticados histológicamente como carcinoma de células de transición in situ (n=1) y tumores mixtos (n=7) con un componente epitelial (carcinoma de células de transición) y un componente mesenquimatoso (hemangiosarcoma). En todos los casos se observó una reacción inflamatoria crónica asociada en el área adyacente no tumoral. Este hecho, junto con el alto grado de displasia celular encontrado en las cistitis crónicas (20,4%), apoya la hipótesis de que las cistitis crónicas en ganado adulto expuesto a la ingestión de heléchos están relacionadas con el efecto tóxico y carcinogenético de esta planta. el estudio inmunohistoquímico de h-ras, ki-67 y p53 en las vejigas de la orina, mostró positividad nuclear y citoplásmica con los anticuerpos frente a p53 y h-ras y únicamente nuclear en el caso de ki-67. El estudio estadístico indicó un incremento significativo (p<0,0001) del valor medio de h-ras en cistitis crónicas y procesos tumorales respecto a vejigas normales, un incremento significativo (p<0,0001) del valor medio de ki-67 en vejigas tumorales respecto a cistitis crónicas y vejigas normales y un incremento significativo (p= 0,01) de p53 en los tumores respecto al grupo de vejigas normales y de cistitis crónicas. Dada su relación significativa con los marcadores empleados, las características histopatológicas de las cistitis crónicas que más podrían relacionarse con el avance del proceso tóxico/neoplásico son: el aumento difuso del número de capas del epitelio, la inflamación difusa y la presencia de agregados linfocitarios. Las muestras vesicales mostraron positividad a tnf-a en el citoplasma de las células del epitelio de transición, células endoteliales de los vasos, fibroblastos y células inflamatorias de la lámina propia y células musculares lisas en vejigas de la orina normales y en las cistitis crónicas. También se observó positividad en el parénquima y estroma tumorales. La expresión inmunohistoquímica de tnf-a en tejido vesical mostró un incremento significativo (p<0,0001), de la intensidad de tinción con tnf-a en vejigas con procesos tumorales respecto a cistitis crónicas y en éstas respecto a vejigas sanas en todas las células estudiadas. La expresión de tnf-a en el epitelio de transición se incrementó de manera estadísticamente significativa en asociación con los otros marcadores empleados (h-ras, ki-67 y p53), indicando su relación con el proceso tóxico/neoplásico. El estudio inmunohistoquímico para la detección de cuerpos de inclusión intranucleares de bpvs no permitió observar en ningún caso la presencia de los mismos, acorde con la no-visualización histológica. el examen microscópico del sedimento urinario reveló la presencia de hematuria (macro y microhematuria) en un 19,3% (explotación a) y un 17,1% (explotación b) de los casos. Existió un incremento de las células descamadas del epitelio de transición en un 50,87% (explotación a) y un 39% (explotación b) de las muestras y la presencia de nidos celulares en un 40,35% (explotación a) y un 17% (explotación b). El diagnóstico citológico fue de procesos hiperplásicos/inflamatorios en un 36,13% de los casos. El escaso número de bacterias patógenas encontradas y la ausencia de piuría permitió descartar el origen infeccioso de estos procesos. La tinción inmunocitoquímica de las citologías, no ofreció un número suficiente de células positivas/negativas como para establecer resultados fiables. la detección de tnf-a en suero, indicó un incremento de los valores de tnf-a en las vacas del grupo a (62,97±49,94 pg/ml) respecto a las vacas utilizadas como control (47,18±16,61 pg/ml), aunque no de forma significativa (p=0,069). El aumento observado en los valores séricos de tnf-a podría explicarse, tal y como se ha explicado en ratas, por la exposición a carcinógenos (ptaquilósido) contenidos en el helécho, ya que no se ha encontrado otra patología (incluyendo parasitosis) en las exploraciones clínicas y analíticas realizadas en estos animales. el estudio molecular del gen h-ras, en los codones analizados, no detectó ningún tipo de error en la síntesis del dna que pudiera explicar la sobreexpresión inmunohistoquímica de esta proteína en el citoplasma celular. El análisis molecular mediante pcr de papilomavirus bovino (bpv) reflejaron la presencia de adn de bpv en un 37,5% (3/8) de las vejigas. La técnica inmunohistoquímica anti bpv no fue positiva en ningún caso analizado. Mediante la técnica de difíerential display, se encontraron 19 bandas expresadas tanto en las cistitis crónicas como en los tumores, indicando la expresión de estos genes y su posible participación en el desarrollo de la heb. De ellas, 13 pudieron ser secuenciadas e identificadas como los genes codificantes para las proteínas zbtp4, flj20760, ltbp1, erbp, cald1, mylkquinasa, bov-a, titin, s16s ribosomal, rnf20, collllai y l18a ribosomal (chr7). Se caracterizó la banda 13 (colágeno intersticial tipo iii), sin detectarse mutaciones de interés. Son necesarios futuros estudios en profundidad para conocer las alteraciones génicas en esta enfermedad.
Datos académicos de la tesis doctoral «Hematuria enzootica bovina. estudio de preValencia en mataderos. aspectos histopatologicos, inmunohistoquimicos y moleculares«
- Título de la tesis: Hematuria enzootica bovina. estudio de preValencia en mataderos. aspectos histopatologicos, inmunohistoquimicos y moleculares
- Autor: David Sardon Ruiz
- Universidad: Complutense de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 14/10/2006
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Laura Luisa Peña Fernandez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Juan a María Flores landeira
- José Carlos Gomez villamandos (vocal)
- Fernando anibal Vasquez fernandez (vocal)
- Luis Lujan lerma (vocal)