Tesis doctoral de Cesar Del Rio Merino
La proteína ykba de bacillus subtilis, purificada y reconstituida en proteoliposomas (pls), presenta actividad de intercambio de l-serina, l-threonina y l-aminoácidos aromáticos. Por ello lo renombramos como ste t (serine/threonine exchanger transporter). Los estudios cinéticos de al actividad de ste t son compatibles con un mecanismo secuencial del intercambio. Ste t se agrupa filogenéticamente dentro de la familia lat. Por todo ello, ste t es el primer homólogo procariota de la familia lat que ha sido identificado y caracterizado. Proponemos ste t como modelo procariota para el estudio funcional y estructural de la familia lat. Los estudios estructurales de ste t mediante electroforesis no desnaturalizante y tem con tinción negativa y con criofractura en pls indican que el intercambiador es funcional como monómero. Ste t tiene apariencia de donut elíptico con diámetros exteriores de aproximadamente 6 y aproximadamente 7nm. El residuo c291 en el segmento transmembrana ™ viii de ste t es la única diana de inactivación por mtset y de activación por dtt. El sustrato l-serina protege de la inactivación por mtset. Por tanto, el sustrato bloquea directamente o provoca un cambio conformacional que bloquea la accesibilidad de mtset al residuo. El segmento tm viii presenta dos caras funcionalmente diferenciables con periodicidad de hélice a. Una cara está formada por los residuos i285, i288, l292, k295 y f299 que mutados a cisteína muestran inhibición por mtset y son insensibles a dtt. La otra cara, adyacente a la anterior, está formada por los residuos s287, g290, g294 y s298 que mutados a cisteína muestran activación por dtt y son insensibles a mtset. Los residuos i284 y c291 poseen características de ambas ya que se inactivan por mtset y se activan por dtt. Dtt activa aproximadamente 20 veces ste t cysless g294c en pls, muy probablemente incrementado la v subíndice máx sin afectar la k subíndice m aparente. Esta activación es protegible por el sustrato l-serina con una ec subíndice 50 similar a su k subíndice m aparente. Por tanto, el sustrato bloquea directamente o provoca un cambio conformacional que bloquea la accesibilidad de dtt al residuo. La mutación k295c, tanto en su entorno cysless como wf, genera un transportador aproximadamente 50 y aproximadamente 260 veces más rápido que ste t y ste t cysless respectivamente. La mutación k295g provoca un efecto muy inferior y la mutación k295l rinde un transportador inactivo. Estos datos sugieren que no hay una relación directa entre el tamaño de la cadena lateral e la posición 295 y la actividad de ste t, si no que la presencia de cisteína es la causante del aumento de actividad. Los residuos i285 y k295 parecen presentar interacción con la cadena lateral del sustrato ya que las mutaciones i285c y l295c producen un cambio dramático en el patrón de cisinhibición. En estos mutantes la mayoría de los aminoácidos estudiados inhiben ampliamente el transporte de l-serina, con la excepción de l-prolina, l-hidroxiprolina, l-glutamato y glicina. En este sentido, ste t cysless k295c presenta un claro cambio de especificidad de sustrato ya que, a diferencia de ste t, transporta l-arginina. El hecho de que i285 y k295 disten aproximadamente 16 a indicaría la existencia de al menos dos lugares de unión independientes de la cadena lateral del sustrato, contradiciendo el modelo de alternating access.
Datos académicos de la tesis doctoral «Caracterizacion del transportador stet: primer modelo procariota de la familia lat«
- Título de la tesis: Caracterizacion del transportador stet: primer modelo procariota de la familia lat
- Autor: Cesar Del Rio Merino
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 20/07/2007
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Manuel Palacín Prieto
- Tribunal
- Presidente del tribunal: carmen Araon rueda
- jordi Hernández borrell (vocal)
- octavi Viñas folch (vocal)
- ignaci Fita (vocal)