Tesis doctoral de María Amparo Martínez Gómez
La naturaleza quiral de los sistemas vivos tiene implicaciones evidentes sobre la actividad biológica de los compuestos que interaccionan con éstos. A nivel molecular, la quiralidad representa una propiedad intrínseca de los componentes esenciales de la vida, como aminoácidos, azúcares, péptidos o proteínas. Como consecuencia, todos los procesos que tienen lugar en los organismos vivos son sensibles a la estereoquímica. la quiralidad tiene implicaciones en diferentes campos científicos como en el campo medioambiental, clínico, agroalimentario y farmacéutico. En el campo medioambiental más del 25% de los plaguicidas que se utilizan son quirales y se comercializan como mezclas racémicas pudiendo cada enantiómero presentar diferente toxicidad, y acumularse y metabolizarse por los organismos vivos de manera selectiva. En el campo clínico, determinados trastornos están directamente relacionados con la presencia de una forma enantiomérica en el organismo o por ejemplo en el campo agroalimentario la detección de d-aminoácidos en alimentos es de especial interés puesto que pueden provocar pérdida del valor nutricional del alimento, que se formen productos poco seguros no metabolizables y formas de aminoácidos no utilizables biológicamente. un campo de creciente interés en la actualidad para la industria farmacéutica, y en el que se están invirtiendo grandes sumas de dinero, es el desarrollo de fármacos enantioméricamente puros, ya que cuando se administra un fármaco quiral a un organismo vivo a menudo se han observado diferencias en las características farmacológicas de los enantiómeros. entre los años 1956 y 1963 se comercializó en europa un fármaco quiral llamado talidomida como sedante y para el tratamiento de las náuseas y vómitos durante los tres primeros meses de embarazo. La talidomida provocó deformaciones congénitas en más de 10000 niños en todo el mundo debido a efectos teratogénicos asociados al enantiómero s. hasta el principio de la década de los 90 la comercialización de fármacos enantioméricamente puros era una recomendación más que un hecho por parte de las autoridades regulatorias. En la actualidad la situación ha cambiado ya que los avances técnicos han permitido la síntesis de compuestos enantioméricamente puros. Así por ejemplo la fda (food and drug administration) ha definido estrictamente los requerimientos para patentar fármacos racémicos que incluyen la evaluación del perfil farmacocinético y farmacodinámico de cada enantiómero y de su combinación. consecuentemente, en la actualidad existe un gran interés en el desarrollo de metodologías que permitan el control de la síntesis enantioselectiva, el control de la pureza enantiomérica y la evaluación del comportamiento farmacológico diferencial de enantiómeros. en esta tesis doctoral se han desarrollado, evaluado y contrastado sistemas «in vitro» basados en técnicas electroforéticas para evaluar la unión de fármacos quirales a las proteínas plasmáticas, para separar los enantiómeros de fármacos básicos quirales empleando albúmina de suero humano (hsa) como selector quiral y para evaluar la unión enantioselectiva de fármacos básicos quirales a las proteínas plasmáticas. con el fin de caracterizar la interacción de fármacos básicos pertenecientes a las familias de beta-bloqueantes, fenotiazinas y antihistamínicos con hsa y alfa1-glicoproteína acida (agp), se ha determinado la constante de afinidad de los fármacos, el número de sitios de unión a dichas proteínas y el porcentaje de fármaco unido mediante análisis frontal. La unión al conjunto de proteínas plasmáticas (hsa, agp, lipoproteínas y/o globulinas, principalmente) se ha caracterizado mediante la determinación del porcentaje de fármaco unido empleando ultrafiltración y electroforesis capilar zonal. los resultados obtenidos indican que la albúmina no sólo presenta afinidad hacia fármacos neutros y ácidos, sino que también hacia compuestos básicos como beta-bloqueantes, fenotiazinas y antihistamínicos. Por otra parte, se ha concluido que la unión de estos fármacos con hsa y agp está directamente relacionada con la hidrofobicidad del fármaco e inversamente, con sus parámetros electrónicos mientras que la unión a las lipoproteínas y/o globulinas está directamente correlacionada con el valor de pka del fármaco e inversamente correlacionada con sus parámetros hidrofóbicos y esféricos. en esta tesis se ha llevado a cabo la separación quiral de fármacos básicos empleando hsa como selector quiral, ya que las proteínas exhiben el más amplio intervalo de enantioselectividad entre los selectores quirales propuestos (ciclodextrinas, antibióticos macrocíclicos, polisacáridos, etc) debido a las múltiples interacciones que tienen lugar entre el fármaco y la superficie de las proteínas. Como técnica se ha empleado la cromatografía electrocinética de afinidad (aekc) y la técnica del llenado parcial (pft). los resultados obtenidos indican que las variables más importantes en la enantioseparación son el ph, la concentración y tiempo de inyección de hsa, siendo el ph la variables más crítica ya que afecta a las constantes de afinidad de los enantiómeros, al grado de ionización del fármaco, al flujo electroosmótico y en consecuencia a las movilidades del fármaco y del selector quiral, y por lo tanto es difícil predecir su efecto en la separación quiral. a partir de propiedades hidrofóbicas, estéricas, electrónicas del fármaco y de afinidad de éste hacia hsa se ha elaborado un árbol de decisión del cual se deduce que sólo aquellos fármacos con carácter hidrofóbico (retención en cromatografía micelar de bio-reparto, logkbmc > 1), baja área polar superficial (psa < 60á2) y bajo volumen molar (vm < 280 cm3) podrán ser enantioseparados. la optimización multivariante de las tres variables más influyentes en la separación quiral (ph, concentración de hsa y longitud de selector), ha permitido establecer para cada fármaco, las condiciones experimentales de estas variables que proporcionan una óptima separación quiral del fármaco racémico, teniendo en cuenta el efecto aislado de cada variable así como los efectos debidos a interacciones entre las variables. el ph óptimo de separación ha resultado ser en general próximo al valor del pka del fármaco en presencia de albúmina. A estos valores de ph, el balance fracción neutra/fracción cargada garantiza la interacción hidrofóbica de la forma neutra del fármaco con hsa y la separación electroforética de los enantiómeros de la banda de proteína. las condiciones óptimas de separación obtenidas mediante aekc-pft utilizando hsa como selector quiral se han aplicado al control de calidad enantiomérico en preparados farmacéuticos de oxprenolol, prometazina, trimeprazina, bromfeniramina, clorfeniramina e hidroxicina. Estos métodos han resultado ser adecuados en términos de simplicidad, coste, linealidad, precisión, recuperación y exactitud. hsa ha demostrado ser un selector quiral más potente en términos de resolución y tiempos de análisis que rifamicina b, beta-ciclodextrinas, albúmina bovina, ovoglicoproteína, heparina y ovomucoide para la separación quiral de los fármacos arriba citados. con el fin de evaluar la unión enantioselectiva de fármacos básicos a las proteínas plasmáticas se ha desarrollado en esta tesis doctoral una nueva metodología adecuada para fármacos que presentan una gran afinidad por las proteínas. Esta metodología consiste en la separación de la fracción de fármaco unido de la fracción de fármaco libre, en la liberación del fármaco unido a las proteínas mediante precipitación de éstas con disolventes orgánicos (metanol, acetonitrilo) y en la separación quiral y determinación de los enantiómeros del fármaco liberado mediante aekc-pft y hsa. aplicando esta metodología, se ha evaluado la unión enantioselectiva de bromfeniramina, clorfeniramina, hidroxicina y orfenadrina a hsa y de bromfeniramina, clorfeniramina, hidroxicina, orfenadrina y fenindamina, prometazina, trimeprazina y bupivacaína al conjunto de proteínas plasmáticas. respecto a la unión a hsa, se han determinado las constantes de afinidad de los enantiómeros y se han identificado los sitios de unión de los enantiómeros en la molécula de proteína. Los estudios han concluido que los enantiómeros de bromfeniramina y clorfeniramina se unen al mismo sitio, al sitio ii de la molécula de hsa. En el caso de orfenadrina, el primer enantiómero eluido se une principalmente al sitio de unión iii pero para el segundo enantiómero, no puede concluirse si no se une a ninguno de estos tres sitios o por el contrario, tiene una gran afinidad por todos y consecuentemente, el marcador de ligando no es capaz de desplazarlo. Para el primer enantiómero eluido de hidroxicina tampoco pueden extraerse conclusiones pero el segundo enantiómero se une principalmente al sitio i. Estos resultados representan la primera evidencia de la unión enantioselectiva de antihistamínicos a hsa y de la unión enantioselectiva de fármacos como bromfeniramina, hidroxicina, orfenadrina, fenindamina, prometazina y trimeprazina a las proteínas del plasma humano en condiciones fisiológicas. por último señalar que los estudios llevados a cabo en esta tesis doctoral pueden resultar de interés para el entendimiento de las propiedades farmacológicas de los fármacos y para la industria farmacéutica en su tarea de desarrollar formulaciones que contengan sólo el enantiómero terapéuticamente activo y de gran repercusión en la práctica clínica.
Datos académicos de la tesis doctoral «Evaluación de la interacción de fármacos básicos con las proteínas plasmáticas mediante electroforésis capilar. estudios de enantioselectividad y aplicaciones analíticas«
- Título de la tesis: Evaluación de la interacción de fármacos básicos con las proteínas plasmáticas mediante electroforésis capilar. estudios de enantioselectividad y aplicaciones analíticas
- Autor: María Amparo Martínez Gómez
- Universidad: Universitat de valéncia (estudi general)
- Fecha de lectura de la tesis: 09/05/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María José Medina Hernández
- Tribunal
- Presidente del tribunal: victor Jimenez torres
- Juan a Rodríguez flores (vocal)
- amparo Salvador carreño (vocal)
- alejandro Cifuentes gallego (vocal)