Tesis doctoral de Manuel Ruben Alarcon Vivero
Las lipasas son enzima con numerosas aplicaciones en biocatálisis debido a su reacción natural, hidrólisis de enlaces éster, como a su utilización en reacciones de transesterificación y síntesis orgánica. Se destaca como productor de lipasas la levadura candida rugosa. Existen lipasas comerciales de este microorganismo, pero tienen el inconveniente de ser una mezcla de isoenzimas que hace inviable el proceso de purificación. La alternativa es la producción heteróloga de la lipasa 2 en otro microorganismo. No obstante, esta vía topa con la peculiaridad de que c. Rugosa no sigue el código genético universal para el amino ácido serina. con objeto de obtener el gen sintético, se diseñó y optimizó la secuencia nucleotídica de rlip2 para su expresión en pichia pastoris, su inserción en el vector de expresión ppicz? Bajo el control transcripcional del promotor de la alcohol oxidasa, su transformación en p. Pastoris y la selección de clones productores de rlip2 activa. comprobada la obtención de clones productores de rlip2 funcional, se determinó el ph óptimo de producción mediante estrategias de operación en discontinuo, paso previo a la optimización de la operación en discontinuo alimentado. al trabajar con fermentaciones en discontinuo alimentado no se detectó presencia de actividad lipásica. Análisis por western blot revelaron que estábamos en presencia de agregados de rlip2, que no tenían actividad lipásica. la hipótesis que se planteó para justificar la formación de los agregados de rlip2 fue la elevada salinidad del medio de cultivo. Mediante la disminución de la fuerza iónica del medio mediante ultra y diafiltración se recuperó la actividad enzimática, detectando el monómero de rlip2. La producción del producto heterólogo fue diez veces superior a la del microorganismo natural. se realizó una caracterización bioquímica y funcional determinándose el óptimo de temperatura y ph, su especificidad frente a p-nitrofenoles y triglicéridos. El estudio de estabilidad demostró que la enzima recombinante en solución era menos estable que la nativa. No obstante, al inmovilizar la rlip2 se consiguió obtener una isoenzima más estable con el valor añadido de poder ser reutilizada. finalmente, se realizaron aplicaciones biocatalíticas de rlip2 en reacciones de síntesis enantioméricas para la resolución de mezclas racémicas de compuestos de interés farmacéutico. Si bien para la resolución racémica del trans-2-fenil-1-ciclohexanol, la rlip2 no fue tan efectiva como la isoenzima nativa, para la resolución del ibuprofeno, se obtuvieron mejores resultados en términos de conversión, exceso y factor enantiomérico que con la nativa.
Datos académicos de la tesis doctoral «Produccion de la lipasa lip2 de candida rugosa en el sistema pichia pastoris: caracterizacion y aplicacion en reacciones de sintesis«
- Título de la tesis: Produccion de la lipasa lip2 de candida rugosa en el sistema pichia pastoris: caracterizacion y aplicacion en reacciones de sintesis
- Autor: Manuel Ruben Alarcon Vivero
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 17/07/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Francisco Valero Barranco
- Tribunal
- Presidente del tribunal: javier Lafuente sancho
- gloria Caminal saperas (vocal)
- María Luisa Rua rodriguez (vocal)
- pilar Diaz lucea (vocal)