Tesis doctoral de Sandra Acosta Verdugo
Los tumores neuroblásticos son los tumores sólidos más frecuentes de la infancia y derivan de las células de la cresta neural (ccn). Tanto, in vitro como in vivo, se han podido identificar una subpoblación celular neuroblástica y otra glial. Además in vitro se han identificado células con características intermedias entre ambos subtipos, de manera que se han propuesto como posibles células iniciadoras de tumor (tic) (ross y spengler, 2007). El objetivo de este trabajo fue investigar la existencia de una subpoblación de células precursoras en tumores neuroblásticos mediante la identificación de células bipotenciales y su posterior caracterización. en primer lugar, las líneas celulares de los diferentes subtipos (neuroblástico (n), glial (s) e intermedio (i)) se caracterizaron morfológica, inmunofenotípica y molecularmente, según marcadores característicos de las células de la cresta neural y de los diferentes subtipos celulares. Los resultados obtenidos indicaron que todas líneas celulares expresaban las proteínas de la cresta neural analizadas, aunque con menor intensidad en el subtipo s. La expresión del gangliosido de membrana gd2 y de la calciclina (s100a6) permitieron discriminar fenotípica y molecularmente entre los fenotipos neuroblástico y glial, respectivamente. La inducción de la diferenciación neuronal y glial, con ácido all-trans retinoico (atra) y bromodesoxiuridina (brdu) mostró que los subtipos n e i mantenían la capacidad de diferenciar tanto en el linaje neuronal como glial, mientras que las líneas de subtipo s parecían comprometidas en la diferenciación del linaje glial. para estudiar la presencia de células con características bipotenciales en los tumores neuroblásticos, se analizó inmunofenotípicamente la expresión de gd2 y calciclina en criosecciones de estos tumores al diagnóstico, post-tratamiento y de metástasis. En todas las muestras analizadas, se observó como existía una subpoblación neuroblástica mayoritaria gd2+/calciclina- y otra gd2+/calciclina+, que presentaba mayor preValencia en las regiones perivasculares y en los neuroblastomas de pronóstico favorable. Se identificaron regiones estromales mayoritariamente gd2-/calciclina+, y otras gd2+/calciclina+, en ocasiones conteniendo vasos con tinción concomitante de ambos marcadores, gd2 y calciclina, sugiriendo un posible origen tumoral de algunas regiones estromales y vasos. Sin embargo, estos neuroblastos gd2+/calcicliina+ no mostraron relación con erbb3 y sox10, dos marcadores de linaje glial. Durante la diferenciación con atra en las líneas celulares neuroblásticas aparecen neuroblastos con expresión concomitante de gd2 y calciclina, que posteriormente adquieren morfología s-like, sugiriendo que los neuroblastos gd2+/calciclina+ son neuroblastos en un estadio inicial de la diferenciación glial. las diferentes subpoblaciones identificadas según el marcaje de gd2 y calciclina fueron separadas por citometría de flujo y se analizó la amplificación del oncogén nmyc, una de las anomalías génicas identificadas más frecuentemente en neuroblastoma. Se observó cómo todas las subpoblaciones (gd2+/calciclina-; gd2+/calciclina+; gd2-/calciclina+) poseían la amplificación del oncogén nmyc, indicando que las diferentes subpoblaciones tumorales provienen de una célula originaria común. para obtener una buena representación celular en los cultivos primarios derivados de tumores neuroblásticos se optimizó el protocolo de cultivo utilizando colagenasa iv para la disgregación celular y, como medio de cultivo, rpmi 1640 suplementado con el 10% de suero bovino fetal. Se observó que los tumores más indiferenciados y de pronóstico desfavorable estaban enriquecidos en células neuroblásticas. Se observó que la subpoblación de neurosferas derivada del cultivo primario contenía una gran variabilidad según la expresión de los marcadores gd2 y calciclina. Además, a partir del protocolo de cultivo optimizado en este trabajo, se obtuvieren 7 líneas celulares continuas compuestas mayoritariamente por neuroblastos. en conclusión, en este trabajo se han caracterizado los diferentes subtipos de líneas celulares de neuroblastoma encontrándose que todos ellos representan un estado indiferenciado aunque no equivalente. Se ha identificado una subpoblación neuroblástica bipotencial en los neuroblastomas, prevalente en los tumores de pronóstico más favorable y asociado a la diferenciación estromal. Además, estas células comparten una célula originaria común con las regiones estromales y las neuroblásticas. En última instancia, se ha optimizado el protocolo de cultivo primario derivado de tumores neuroblásticos.
Datos académicos de la tesis doctoral «Avances en la identificación y la caracterización in vitro y molecular de células precursoras en tumores neuroblásticos«
- Título de la tesis: Avances en la identificación y la caracterización in vitro y molecular de células precursoras en tumores neuroblásticos
- Autor: Sandra Acosta Verdugo
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 02/02/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Jaume Mora Graupera
- Tribunal
- Presidente del tribunal: enrique De álava casado
- samuel Navarro fos (vocal)
- (vocal)
- (vocal)