Tesis doctoral de Maher Al-atari Abou
Hay diversos estudios donde se demostró la importancia de estas células y su capacidad regenerativa. Obtuvieron a partir de estas células, mediante la adición de citoquinas tejido-específicas, células diferenciadas in vitro, no sólo de linaje mesenquimático sino también endo y ectodérmico. Nuestro grupo está particularmente interesado en establecer un protocolo para el aislamiento y la identificación de subpoblaciones de células cd13+, ssea-4+, oct3/4+, nanog, que puedan ser aplicadas en futuros protocolos de regeneración de muchos tipos de tejidos de las tres capas embrionarias. Sin embargo hasta la fecha de hoy no hay estudios realizados donde se muestra la presencia de células de carácter embrionario en la pulpa dental con expresión de genes como ssea-4, oct3/4, nanog, sox2, c-myc, cd13, y características parecidas a mapcs, células progenitoras multipotenciales adultas y asiladas a partir del cultivo in vitro de la medula ósea. El objetivo de esta tesis ha sido demostrar la presencia y la importancia de células madre, mucho más potentes (pluripotenciales) de lo que se pensaba, en la pulpa dental de los terceros molares. en los resultados obtenidos en esta tesis se demuestra la presencia de estas células en la pulpa dental de los terceros molares con porcentajes diferentes respecto al tiempo de cultivo y a la edad del paciente. El porcentaje de células pluripoteciales de la pulpa dental, aunque siempre presentes, por lo que deducimos que el aislamiento siempre será posible, disminuye a medida que aumenta la edad. durante el análisis de la morfología de las células en esta tesis se observó la formación de colonias que mostraban características muy parecidas a las células madre embrionarias. Se observó que, la densidad del sembraje debía ser muy baja (de 80 a 100 células por cm²) y la densidad máxima del cultivo debía tener una confluencia de 70 a 80% antes de hacer el pase. Se observó también que al sembrar con una densidad más alta y con una confluencia superior al 80%, dichas células perdían su morfología y su fenotipo. Una diferencia notable con publicaciones anteriores de mapcs es afirma que el cultivo de las mapss es heterogéneo y en él cohabitan dos poblaciones celulares con destinto fenotipo (grandes y pequeñas), pensamos que las células pequeñas que son células con características muy parecidas a las células mapas de la medula ósea, como esta descrita por la dra verfaillie, en nuestro análisis del fenotipo por facs sembré hemos entintado coger solo las células de menor tamaño y eso que nos daba el fenotipo correcto. en la fase final, tras aislarlas, y estudiar su fenotipo, se demostró (mediante la morfología, inmunohistología y rt-pcr) la pluripotencialidad de mapcs de la pulpa dental, diferenciándolas a tres tipos de tejidos de las tres capas embrionarias tal y como otros autores demostraron la pluripotencialidad de estas células de medula ósea. este estudio no concluye aquí sino que, a partir de los resultados obtenidos queremos abrir nuevas vías para futuros estudios en medicina regenerativa, y concretamente en el campo de la odontología (regeneración de tejido óseo y dental), con células de carácter embrionario de muy fácil acceso y con una potencia regenerativa pluripotencial. objectivos: objetivo general: demostrar la presencia de células madre pluripotenciales con un fenotipo ssea-4+, oct3/4+, nanog+, cd13+, sox2, c-myc, en la pulpa dental, y demostrar su potencia de diferenciación a cuatro tipos de tejidos de tres capas embrionarias. objetivos específicos: ¿ hacer una revisión bibliográfica de las técnicas utilizadas para el asilamiento y cultivo de dpsc y las posibilidades de presencia de mapcs en la pulpa dental durante los últimos 2 años 2007-2009. ¿ establecer el protocolo de aislamiento y cultivo de células madre pluripotenciales a partir de pulpa dental. ¿ demostrar la presencia de mapcs en la pulpa dental utilizando varias técnicas como facs, rt-pcr, inmunohistoquímica. ¿ calcular el porcentaje de las proteínas específicas de pluripotencialidad en diferentes tiempos de cultivo. ¿ calcular el porcentaje de estas células presentes en la pulpa dental del tercer molar en diferentes edades sin realizar cultivo, en el mismo día de la extracción. ¿ demostrar por q-rt-pcr e inmunohistoquímica, la pluripotencialidad de estas células diferenciándolas a diferentes tipos de tejidos de diferentes capas embrionarias. material y métodos: a partir de la pulpa dental del tercer molar de 20 muestras de diferentes pacientes de distintas edades inmediatamente después de la extracción de los terceros molares .Se realizó un corte entre el esmalte y el cemento utilizando una fresa cilíndrica de turbina sujetando el diente con fórceps de incisivos superiores. El siguiente paso fue realizar la separación celular mediante la digestión con colagenasa a 37º c, posteriormente se sembraron las células en medio de cultivo que contiene: dmem (low glucose), mcdb, site, la-bsa, pen/strep, l-ascorbic acid, fbs, pdgf, lif, egf, bsa, chemically defined lipid concentrate, íY-mercaptoethanol. Se ha realizado el análisis por citometría de flujo para estudia el fenotipo de estas celulas en deferentes pases y deferentes edades caracterización completa de los marcadores de superficie y intracelulares, y de la potencialidad de diferenciación a las tres capas embrionarias de las células madre adultas aisladas a partir de la pulpa dental los marcadores se analizaran mediante citometría de flujo, rt-pcr a tiempo real.
Datos académicos de la tesis doctoral «Obtención y purificación de una población de células madre pluripotenciales, en la pulpa dental de los terceros molares«
- Título de la tesis: Obtención y purificación de una población de células madre pluripotenciales, en la pulpa dental de los terceros molares
- Autor: Maher Al-atari Abou
- Universidad: Internacional de catalunya
- Fecha de lectura de la tesis: 22/07/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Núria Casals Farré
- Tribunal
- Presidente del tribunal: jordi Cervós navarro
- eduard Ferres (vocal)
- (vocal)
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