Tesis doctoral de Silvia Calabuig Fariñas
Tesis doctoral: significado clínico- patológico de las mutaciones de los genes c-kit y pdgfra en tumores del estroma del tracto gastrointestinal. 1-introducción los tumores del estroma gastrointestinal (gist) son las neoplasias mesenquimatosas más comunes del tracto gastrointestinal; pero hasta hace bien poco estas neoplasias eran diagnosticadas como leiomiomas o leiomiosarcomas. Para esta diferenciación fue primordial el descubrimiento por parte de hirota y cols. De la hiperexpresión del receptor de membrana c-kit (cd117) que se detecta en un 95% de los gist. Esta hiperexpresión se detecta inmunohistoquímicamente y en el 85% de los casos es consecuencia de las mutaciones activantes en los exones de c-kit que codifican para la región yuxtamembrana y dominios tirosina quinasa del receptor.1. Recientemente, se ha descrito que entre el 5-7% de gist no expresan kit, sino que lo hacen para otro receptor de la misma familia que c-kit, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas alfa (pdgfra) 2. 2-epidemiología y manifestaciones clínicas los gist son los tumores mesenquimales más comunes del tubo digestivo con una incidencia del 1% de todos los tumores gastrointestinales. La incidencia de estas neoplasias es máxima con una ligera predilección por los varones entre la cuarta y la sexta década de vida. Desde el punto de vista clínico, los gist son tumores esporádicos y únicos; excepcionalmente se han diagnosticado en una misma familia diferentes casos de estas neoplasias 3; también se ha observado que hay enfermedades que aumentan el riesgo de gist como la neurofribromatosis tipo i (nf1) pero en estudios realizados no se ha detectado ninguna mutación en el gen c-kit por lo que la patogénesis de los gist procedentes de nfi es diferente de los gist sin nfi. 4. la mayor incidencia de estos tumores se produce en el estómago (50-60%), seguido del intestino delgado (20-30%), el esófago (5%) y otro 5% en el resto de la cavidad abdominal. Se han descrito en localizaciones extragastrointestinales como el mesenterio, el omento, retroperitoneo e incluso la pared vesical y la vesícula biliar. El pronóstico clínico presenta cierta asociación con la distribución anatómica (independiente del tamaño, del número de mitosis y de la edad del paciente) con una tendencia a ser de mayor malignidad los localizados en intestino delgado y más benignos los esofágicos. Cuando recidivan tienden a hacerlo en la cavidad peritoneal en forma de múltiples nódulos peritoneales, hígado, y con menor frecuencia en huesos. Las metástasis hepáticas son comunes en las recaídas 5 . 3-diagnóstico inmunohistopatológico histológicamente, en los gist se distinguen tres variantes: la variante fusocelular (70%), la variante epiteloide (20%) y los tipos mixtos (5%); difícilmente se observan formas atípicas. -gist con diferenciación fusocelular se caracterizan por tener las células alongadas, uniformes, dispuestas en fascículos cortos o paralelos u ondulados; las células poseen citoplasma pálido, eosinófilo, semejando células musculares lisas. Tienen tendencia fibrilar y márgenes imprecisos con aspecto sincitial. El núcleo oval, alongado, tiene cromatina laxa y nucleolo poco prominente. Componente estrómico escaso. Vacularización capilar fina. gist con diferenciación epitelioide tienen células con un aspecto poligonal y citoplasma acidófilo bien definido. Disposición homogénea, uniforme con núcleos redondos u ovales de cromatina laxa. Carecen de secreción citoplasmática. por último, gist con variante mixta se encuentran áreas epitelioides y fusocelulares, incluso se encuentran células de tipo transicional en que progresivamente van adoptando una apariencia epitelioide a partir de formas fusiformes o viceversa. en ocasiones, los gist pueden presentar diferenciación neuronal, muscular o ambas; dependiendo de esta diferenciación se utilizarán unos marcadores u otros, pero el marcador por excelencia que siempre se expresa es c-kit (cd117). A nivel inmunohistoquímico está positividad, que alcanza valores entre el 20-100%, tiene que ser intensa, citoplasmática y membranosa6. además de cd117 se utilizan otros marcadores para poder asegurar el diagnóstico como son el cd34 (60-70% de positividad), la actina del músculo lisa (30-40%) y sma (5-10%). se produce positividad para marcadores neuroendocrinos en aquellos casos que son clasificados como gant (tumor gastrointestinal del nervio autonómico) tienen una diferenciación neuronal; como son sinaptofisina, cromogranina y enolasa neuronal específica. 4-biología molecular el descubrimiento por parte de hirota et al de las mutaciones activantes en el protooncogen c-kit juntamente con la positividad para su marcador inmunohistoquímico cd117 ha abierto una nueva era para estos tumores tan agresivos y con tal mal pronóstico. 1 se ha visto que las mutaciones de c-kit constituyen un evento precoz en el desarrollo de estas neoplasias; siendo más frecuentes en gist malignos que en benignos, así como en la variante fusocelular que en la epitelial; y no apareciendo nunca en leiomiomas ni en leiomiosarcomas.10 la proteína kit está codificada por el protooncogen c-kit, el cual está constituido por 21 exones y se localiza en el brazo largo del cromosoma cuatro (4q12) en una región de 70kb.11 kit es un receptor transmembrana que posee actividad tirosin quinasa tipo iii y cuyo ligando es el stem cell factor (scf). También pertenecen a esta familia de receptores el pdgfra, pdgfríY y el receptor del factor estimulante de la formación de colonias de macrófagos i. Cada uno de estos receptores se caracteriza por un dominio extracelular de unión al ligando que contiene cinco repeticiones similares a las inmunoglobulinas, un dominio transmembrana y uno intracitoplasmático donde se encuentra la actividad tirosina quinasa del receptor. Cuando se une el ligando a estos receptores se produce la homodimerización 12 de los receptores con la consiguiente activación de los dominios tirosina quinasa intracitoplasmáticos. Las quinasas activadas, fosforilan a su vez y de forma cruzada, residuos de tirosina en la molécula opuesta lo que provoca un cambio de conformación del complejo y la consiguiente activación del receptor. Estas tirosina fosforiladas sirven como sitios de unión para una serie de proteínas de señalización celular que desencadenan un intrincado de vías de transducción de señales que controlan funciones celulares de proliferación, adhesión celular, apoptosis, migración y diferenciación. en muchos estudios se ha alcanzado un 85% de mutaciones en el gen c-kit; produciéndose en su mayoría en heterozigosis. Estas mutaciones pueden ser: deleciones, duplicaciones, mutaciones puntuales o codones stop. En este protooncogen los exones más afectados son los que se encuentran en la región yuxtamembrana [exón 11(67%)13, el exón 9 (17%)14] y dominios tirosina quinasa [exones 13 y 17 (1%)]9, 15, 16 se han descrito gist con una negatividad inmunohistoquímica para cd117, sin embargo a nivel molecular se han hallado mutaciones en el gen c-kit 17. aunque la mayoría de mutaciones se producen en c-kit, entre un 5-7% de los casos se encuentra mutado el protooncogen pdgfra (receptor del factor de crecimiento plaquetario alfa) constituido por 23 exones de aproximadamente 65kb y se encuentra en la misma región que kit (4q12). Heinrich y cols (sciencie 2003) observaron que las mutaciones se producían en su mayor número en los exones 12 y 18. Además no encontró ninguna mutación en pdgfra si anteriormente se había hallado mutación en el c-kit, por lo que son mutaciones mutuamente excluyentes pero con consecuencias biológicas similares en la patogénesis de los gist los mecanismos por los cuales las mutaciones de kit y pdgfra conducen a la activación del receptor independiente de ligando no están claros, aunque en algunos casos las proteínas mutadas presentan cambios estructurales que favorecen la oligomerización del receptor y la fosforilación cruzada incluso en ausencia de ligando. Los tipos de mutaciones confieren distintos grados de activación, lo cual se puede traducir en diferencias en cuanto a la agresividad del tumor18. los receptores tirosina quinasa tipo iii son candidatos de ser dianas terapéuticas para el imatinib mesilato, droga que se utiliza desde hace años en el tratamiento de las leucemias mieloides crónicas con muy buenos resultados y que se ha empezado a utilizar en los gist con muy mal pronóstico 19 además de otros tumores como dermatofibrosarcoma protuberans, melanomas, fibromatosis, desmoides, sarcomas sinoviales y sarcomas de ewing. Este medicamento actúa bloqueando los bolsillos de unión del atp de las tirosina quinasas impidiendo así que se produzca la activación del receptor20. 5-hipótesis poder observar una relación directa entre las mutaciones y tipo de mutaciones obtenidas en los dos genes a estudiar (c-kit y pdgfr¿) con la evolución clínico-histopatológica de los pacientes. 6-objetivos los objetivos que se pretenden alcanzar en el presente proyecto de tesis doctoral son: – incidencia de las mutaciones en gist y la incidencia de los diferentes tipos de mutaciones. – dado el número de mutaciones de c-kit es elevado, esclarecer si existe una relación entre la presencia de mutación con las variables clinico patológicas y la evolución del paciente. – si dependiendo de la clase de mutaciones (mutación puntual, delecciones o duplicaciones) y de los codones afectados hay un peor pronóstico para los pacientes. – esclarecer si afecta a la evolución del tumor el número de codones implicados en la mutación; si se pueden observar diferencias si se produce en una región o otra del gen. – se produce un peor pronóstico en aquellos gist que tienen mutados c-kit o pdgfra. – poder estudiar algún gist resistente a imatinib y ver que relación existe con la inmunohistoquímica y histopatología. – determinar la asociación entre el tipo celular con las mutaciones. – valorar el valor pronóstico según el tipo de mutación con el ile (enfermedad libre de incidencia), ilr (enfermedad libre de recurrencia), ilm (enfermedad libre de mortalidad) 7-material y métodos se han recogido un total de 173 casos incluidos en parafina diagnosticados en el periodo comprendido entre los años 1985 y 2007. Una vez obtenido todo el material se ha llevado a cabo un completo estudio histopatológico como mutacional. Del total de casos, 83 pertenecen al hospital clínico de Valencia, 24 casos de la fundación instituto Valenciano de oncología y 65 casos de consulta de hospitales externos. el estudio clínico está basado en el análisis de las historias clínicas de los pacientes depositadas en el archivo central del hospital clínico universitario de Valencia y en la fundación instituto Valenciano de oncología, aquellas historias a las que no se tenía un acceso directo se ha hecho todo lo posible por conseguir los datos de ellas. Se han valorado los parámetros referentes a la situación clínica del paciente que a continuación describimos: -sexo: 1-mujer; 2-varón -edad: se valoró en años el momento en que se emitió el informe anatomopatológico del tumor primario. Obtenida de la fecha de nacimiento y la fecha del diagnóstico. -localización del tumor: estómago, intestino delgado, intestino grueso, extragastrointestinal, hígado y esófago. -tamaño tumoral: en centímetros. -celularidad del tumor: epitelioide, fusoceluloide o mixto. -presencia de pleomorfismo o necrosis. -recuento mitótico según la clasificación de riesgo de fletcher y miettinen. -tipo de tumor: 1-primario; 2-recidiva local; 3-metástasis. -diagnóstico: patológico. -clasificación según los criterios de riesgo de fletcher y miettinen. -tiempo transcurrido hasta la primera recidiva o a las metástasis. -tratados con glivec o no. -cirugía en aquellos casos en que no se ha podido realizar una extirpación completa del tumor se tiene en cuenta porque las recidivas son mayores en esos casos. -intervalo libre de enfermedad (ile): se contabilizó en meses contando desde el diagnóstico anatomopatológico inicial hasta la confirmación histológica de una recidiva o hasta la finalización del seguimiento si no hubo recidiva tumoral. -tiempo de seguimiento: se contabilizó en meses desde el diagnóstico anatomo-patológico inicial hasta la última revisión. -muerte a causa de enfermedad: supervivencia global. el análisis histológico se realizó sobre muestras de tejido tumoral fijadas en formaldehído al 10% e incluidas en parafina. Se cortaron secciones de 5 µm en un microtomo y se montaron en portaobjetos con poly-l-lisina. Para el estudio morfológico, orientado al diagnóstico, se realizaron técnicas convencionales de hematoxilina-eosina. en el estudio inmunohistoquímico cabe destacar que los casos anteriores a 1998 se han estudiado en dos micromatrices titulares y el resto de casos de diagnóstico y consulta en las laminillas convencionales. Las variables histológicas son analizadas para cada tumor con los siguientes criterios: -el recuento mitótico se realiza seleccionando cincuenta campos al azar a 40x. -necrosis (presencia o ausencia). -pleomorfismo (presencia o ausencia). -tipo celular predominante (fusocelular, epitelioide o mixto). -la inmunoreactividad se realiza en los marcadores c-kit, ki-67, mdm2, cromogranina, cd99, cd34, sinaptofisina, vimentina, p53, aml, desmina, s-100, pdgfra. en general, el porcentaje de células neoplásicas o normales con reactividad fue estimado mediante una escala semicuantitativa. además estos tumores son clasificados según el riesgo hisotológico siguiendo los criterios de fletcher (mitosis y tamaño) o miettinen que incluye además la localización: para nuestro estudio de biología molecular necesitamos extraer adn de los tejidos fijados e incluidos en parafina con cinco secciones de 5 micras para poder posteriormente realizar la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (pcr) y posterior secuenciación de los productos obtenidos. Se realiza la extracción del dna, para lo cual, en primer lugar se desparafinan las muestras y se realiza una digestión enzimática en un tampón de lisis. Una vez finalizada la digestión, se procede a la purificación del dna con una extracción de fenol-cloroformo y precipitación etanólica. El dna obtenido se resuspende en un volumen de agua ultrapura. Posteriormente se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa de los exones 9, 11, 13 y 17 del gen c-kit, y 12 y 18 del pdgfra, acotando la región de yuxtamembrana y los dominios tirosina quinasa, donde se producen la gran mayoría de mutaciones de estos genes. Se secuencia bidireccionalmente con los mismos primers que la pcr en un secuenciador automático y seguidamente se estudian las secuencias para caracterizar el tipo de alteración génica. 8-resultados en los siguientes apartados de resultados se incluyen los resultados del análisis estadístico de los parámetros clinicopatológicos, seguido de los resultados inmunohistoquímicos y el estudio mutacional de los genes c-kit y pdgfra; con el objetivo principal de hallar patrones comunes de malignidad o benignidad en los diferentes gist estudiados. en el estudio global, de un total de 173 casos candidatos a ser diagnosticados como gist, finalmente han sido excluidos un total de 30 casos, ya que han sido diagnosticados de otras entidades. se han obtenido todos los datos clínicos de los 143 gist en la revisión de las historias clínicas e informes de anatomía patológica del hospital clínico universitario de Valencia y la fundación instituto Valenciano de oncología, en aquellos casos de consulta de hospitales externos se ha intentado recabar toda la información posible de la evolución de los pacientes. La mediana de seguimiento ha sido de 48 meses, con un mínimo de 0 días (debido al fallecimiento del paciente en el momento de la intervención) y un máximo de 245 meses. del total de casos estudiados, se ha realizado el estudio inmunohistoquímico y mutacional en el tumor primario a 131 casos y 12 han sido estudiados a partir de la recidiva debido a que no ha sido posible obtener el primario. No obstante todo el material posible de un tumor ha sido analizado para poder confirmar los resultados, por esa razón se han estudiado 155 muestras que pertenecen a tumores primarios; de los cuales 2 eran tejido en fresco, 5 de cultivos celulares y un nude; además en aquellos tumores de gran tamaño se cogían las zonas más representativas del tumor para realizar el estudio molecular y así no obtener falsos negativos. De todos los tumores que ha sido posible se han analizado las recidivas (19 muestras) y las metástasis. Los parámetros clínicos e histopatológicos han sido 84 varones y 59 hembras; una mediana de edad de 63 años (24-86); con una localización mayoritaria en el estómago, seguido del intestino delgado y una mediana tumoral de 7,2cm (0,1-40cm); la histología celular mayoritaria es la fusocelular; la mediana de recuento mitósico ha sido de 4 (0-80mitosis en 50hpf). el marcador por excelencia de los gist es kit (cd 117); siendo considerado positivo cuando se detectaba tinción citoplasmática/ membranosa en las células tumorales. Podemos destacar que un 91% de los tumores son positivos a kit; de los cuales tienen una expresión intensa 71 casos (53,4%), 28 con una expresión moderada (21,1%) y 22 con una expresión débil (16,5%). Doce casos de gist resultaron ser negativos para este marcador pero con la ayuda de otros marcadores como el cd34 ó las mutaciones presentes en el gen c-kit o pdgfra se pudo confirmar su diagnóstico (9%). El resto de marcadores quedan ya reflejados en la tabla anterior. Obteniendo en el resto de marcadores: 61,9% de positividad para pdgfra, 52,9% para ki-67 y 42,3% para p53. en el total de los casos, después del estudio de los exones tanto de c-kit como de pdgfr¿ hemos hallado un total de noventa y ocho mutaciones de los ciento cuarenta y tres pacientes (68%). 88 de las mutaciones (90%) se producen en el gen c-kit y únicamente 10 mutaciones en el gen pdgfra (10%). las mutaciones en c-kit ocurren con mayor frecuencia en el exón 11 con un total de 75 mutaciones (80% del total de mutaciones), ocho en el exón 9 de c-kit (8% del total de mutaciones), una en el exón 13 (1% del total de mutaciones) y dos en el 17(2%). Respecto al gen pdgfra se han hallado nueve mutaciones en el exón 18 (9% del total de mutaciones) y una en el exón 12 pero correspondiente a un pólipo fibroide inflamatorio (artículo incluido posteriormente). Se han encontrado dos pacientes con doble mutación en el gen c-kit con diferentes exones implicados. el tipo de mutación observada en el exón 9 de c-kit es la duplicación de los codones 502-503. En el exón 11 de c-kit pudimos distinguir los siguientes tipos de mutación: 44 casos presentaron deleciones intersticiales (59%), diecisiete mutaciones puntuales (23%), nueve casos presentan deleciones más mutaciones puntuales (12%) y por último 5 duplicaciones intersticiales. observando los resultados obtenidos en el exón 11 podemos distinguir dos regiones, una primera que abarcaría desde los codones 550-572 y una segunda región entre los codones 573 y 591. En la primera región se concentrarían las deleciones y mutaciones puntuales sobretodo y en la segunda todas las duplicaciones más alguna deleción o mutación puntual, se puede apreciar este hecho en la figura que sigue. Donde quedan resumidas todas las mutaciones encontradas en el estudio. se ha realizado el estudio de progresión y de supervivencia en todos aquellos gist de los que se disponía de la evolución clínica del paciente, siendo éstos un total de 111 casos. Por falta de seguimiento se han excluido 34 casos. en la muestra total de casos diagnosticados de gist, la mediana de seguimiento ha sido de 52 meses, con un rango de entre 1 a 244,9 meses. Con una supervivencia de la serie a los 5 años del 45% de los casos. de los 111 gist de la serie han recidivado 30, han metastatizado 32 y han fallecido a causa del tumor 36. en el intervalo libre de progresión se incluye el primer evento de progresión que se manifiesta en el paciente, ya sea recaída o metástasis. Obteniendo como parámetros independientes de progresión en el análisis multivariable con la regresión de cox la clasificación de fletcher (p<0,0001), la histología del tumor (p=0,006), el marcador inmunohistoquímico ki-67 (p=0,019), el recuento mitósico superior a 5 mitosis en 50 hpf (p=0,007) y la presencia de mutación en c-kit (p=0,003). se ha realizado el análisis estadístico multivariable para saber qué parámetros significativos en el análisis univariable se comportan como factores pronósticos independientes en la supervivencia la serie global de los gist obteniendo como parámetros el recuento mitósico (p=0,001) y la resección incompleta del tumor (p=0,003). Además también se realizado en los casos no tratados con glivec obteniendo el recuento mitósico (p=0,014) y la resección incompleta (p=0,063); y en los casos tratados con glivec obteniendo la presencia de la delección de los codones 557 y 558 (p=0,026). 9- conclusiones el análisis anatomo-clínico, histológico, inmunohistoquímico, genético y pronóstico de 175 casos de neoplasias gastrointestinales incluibles dentro del contexto de los llamados tumores del estroma gastrointestinal (gist) han permitido obtener las siguientes conclusiones: 1.- El tamaño tumoral, de más de 5cm, e índice mitósico, de más de 5 mitosis por 50hpf, son factores adversos en la progresión y están asociados a otros factores de mal pronóstico como presencia de necrosis, pleomorfismo nuclear, localización extragastrointestinal y resección incompleta. No obstante, aunque estos parámetros predicen una mayor malignidad su ausencia no garantiza un curso clínico benigno. 2.- La localización extragastrointestinal (egists) presenta una evolución más desfavorable que el resto de gist, seguida del colón e intestino delgado. 3.- Otros factores adversos que ayudan a predecir con mayor exactitud la malignidad del tumor son la presencia de necrosis, el pleomorfismo nuclear y la histología celular. Este último parámetro tiene valor pronóstico independiente. 4.- El anticuerpo c-kit (cd117) es un marcador esencial para el diagnóstico de gists, sin embargo, en los casos gist c-kit negativos, el análisis mutacional de c-kit y pdgfr¿ constituye una herramienta importante de confirmación diagnóstica. 5.- La determinación inmunohistoquímica de ki-67 es un parámetro complementario del índice mitósico y constituye un factor pronóstico independiente tanto para supervivencia libre de progresión como para supervivencia global. 6.- Las mutaciones de c-kit o pdgfr¿ son un evento precoz y mutuamente excluyentes en la patogénesis de los gist. Sin embargo, no son mutaciones exclusivamente asociadas con los gist, apareciendo también mutaciones en otras neoplasias, aunque de modo ocasional, como son los pólipos fibroides inflamatorios, los sarcomas sinoviales o melanomas. 7.- La presencia de mutación en c-kit es un factor adverso en la progresión del tumor en la serie global. Sin embargo, aquellos casos portadores de mutación en c-kit son más sensibles al tratamiento con glivec. 8.- Las mutaciones en el exón 9 de c-kit presentan peor pronóstico asociándose a una mayor progresión. Por el contrario, las mutaciones del exón 11 de c-kit se asocian a un pronóstico más favorable. 9.- El tipo de mutación con mejor pronóstico en nuestra serie ha sido la mutación puntual mientras que la deleción intersticial asociada a una mutación puntual se asocia a peor pronóstico. 10.- Los codones más frecuentemente mutados en este estudio son el 557, 558 y 559. La alteración en el codón 558 es la que más frecuentemente se asocia a parámetros de progresión y de pronóstico desfavorable. 11.- Una baja proporción de casos presentaron mutaciones de c-kit en homozigosis. La presencia de alteraciones génicas en homozigosis se pueden considerar como marcador adverso adicional en gist. 12.- Una escisión quirúrgica total es el tratamiento selectivo de los gists; induciéndose aumento de progresión y menor supervivencia en aquellos pacientes que no son sujetos a esta técnica o en los que la resección tumoral fue incompleta. 11-bibliografia 1. Hirota s, isozaki k, moriyama y, hashimoto k, nishida t, ishiguro s, kawano k, hanada m, kurata a, takeda m, muhammad tunio g, matsuzawa y, kanakura y, shinomura y, kitamura y: gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors, science 1998, 279:577-580 2. Wardelmann e, hrychyk a, merkelbach-bruse s, pauls k, goldstein j, hohenberger p, losen i, manegold c, buttner r, pietsch t: association of platelet-derived growth factor receptor alpha mutations with gastric primary site and epithelioid or mixed cell morphology in gastrointestinal stromal tumors, j mol diagn 2004, 6:197-204 3. 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Datos académicos de la tesis doctoral ««significado clínico-patológico de las mutaciones de los genes c-kit y pdgfra en tumores del estroma del tracto gastrointestinal.»«
- Título de la tesis: «significado clínico-patológico de las mutaciones de los genes c-kit y pdgfra en tumores del estroma del tracto gastrointestinal.»
- Autor: Silvia Calabuig Fariñas
- Universidad: Universitat de valéncia (estudi general)
- Fecha de lectura de la tesis: 21/12/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Antonio Llombart Bosch
- Tribunal
- Presidente del tribunal: xavier Matias-guiu guia
- Andrés Cervantes ruipérez (vocal)
- Antonio Martínez lorente (vocal)
- guzman Ortuño pacheco (vocal)