Tesis doctoral de Daniel Sánchez Centellas
La superfamilia de las ribonucleasa a incluye proteínas de propiedades muy diversas, entre ellas rnasas altamente catiónicas con propiedades antipatógenas como: bactericida, antihelmíntica y antivírica. Las dos principales rnasas con capacidad bactericida son la rnasa 3, también conocida como proteína catiónica de eosinófilos, (rnasa 3/ecp), y la rnasa 7, denominada también rnasa derivada de piel. La rnasa 3/ecp fue originalmente identificada como factor liberado por eosinófilos y sus niveles fisiológicos son marcadores ya establecidos en el asma y en varios tipos de inflamaciones y/o infecciones. en este proyecto se plantea establecer cuál es el mecanismo molecular de acción bactericida de la rnasa 3, que presenta abundancia de argininas en su superficie, así como estudiar la potencial participación de la actividad ribonucleasa en el proceso. La rnasa 7 es otra ribonucleasa implicada en el sistema inmunitario de defensa, de carácter igualmente catiónico, en este caso debido a la abundancia de lisinas en su superficie. El conocimiento de esta proteína procede de su purificación a partir de un extracto de epidermis. Su actividad ribonucleasa en las descamaciones epiteliales puede ser uno de los principales factores de degradaciones del rna en las manipulaciones de laboratorio. Su mecanismo de acción aún está por estudiar en detalle. Esta proteína presenta una actividad rnasa superior en relación a la rnasa 3/ecp y al mismo tiempo una actividad bactericida ligeramente superior. la hipótesis de trabajo para el estudio de la rnasa 3/ecp es la identificación de las regiones determinantes de su actividad bactericida. Para ello se han realizado varias aproximaciones: a) la utilización de péptidos resultantes de escisión química y enzimática limitada b) la utilización de péptidos sintéticos y c) la utilización de mutantes en modelos de expresión a pequeña escala que expresan la proteína en su forma soluble. por otra parte, el presente trabajo representa la puesta a punto del primer protocolo de expresión de rnasa 7 recombinante con elevado rendimiento. Se realizó un estudio comparativo entre las dos variantes de la rnasa 7 identificadas a partir de cdna de queratinocitos (variante p75y93) y de cdna proveniente de riñón (variante a75h93). La hipótesis de trabajo para el estudio de la rnasa 7 es la caracterización de su actividad antibacteriana para las dos variantes identificadas comparándolas entre ambas y al mismo tiempo con la rnasa 3. Las propiedades diferenciales de estas proteínas nos facilitarán la comprensión de su función in vivo, durante el proceso de respuesta inmunitaria. adicionalmente se pretende poner a punto, nuevos protocolos de cocristalización de la rnasa 3/ecp con potenciales ligandos naturales, para identificar los residuos de interacción con componentes de la pared bacteriana. para todos estos estudios se utilizaron las siguientes metodologías: para la obtención de péptidos derivados de la rnasa 3/ecp se diseñó un protocolo de escisión enzimática y química. Los péptidos se separaron por gel filtración o por cromatografía de fase reversa. la ecp/rnasa 3 y la rnasa 7 recombinantes se expresaron en e. Coli bl21de3. se clonó el gen de la rnasa 7 en el plásmido de expresión pet11c para su expresión a gran escala como proteína recombinante. El protocolo se ha optimizado en nuestro laboratorio. En dicha expresión la proteína recombinante se agrega formando cuerpos de inclusión, y se recupera mediante su solubilización y procesos de replegamiento y posterior purificación por intercambio catiónico. La segunda variante conocida de la rnasa 7 se obtuvo por mutagénesis dirigida y se expresaron ambas de la misma manera. En caso de requerir la proteína para procesos de cristalización se purifica adicionalmente por cromatografía de fase reversa. las proteínas recombinantes también fueron expresadas a pequeña escala de forma soluble en e. Coli rosetta gami®, en un sistema de expresión que permite realizar un cribado de diferentes mutantes y variantes de las ribonucleasas en estudio, en función de sus efectos sobre la viabilidad del cultivo bacteriano. Dicha viabilidad celular fue evaluada mediante la cuantificación de los niveles de atp. la actividad ribonucleasa de la rnasa 3/ecp y la rnasa 7 se estudiará in vivo, mediante extracción y análisis del rna celular bacteriano.
Datos académicos de la tesis doctoral «Caracterización de la actividad bactericida de la proteína catiónica de eosinófilos (rnasa 3/ecp) y la rnasa derivada de epidermis (rnasa 7). estudio por proteolisis limitada y mutagénesis dirigida.«
- Título de la tesis: Caracterización de la actividad bactericida de la proteína catiónica de eosinófilos (rnasa 3/ecp) y la rnasa derivada de epidermis (rnasa 7). estudio por proteolisis limitada y mutagénesis dirigida.
- Autor: Daniel Sánchez Centellas
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 13/04/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Ester Boix Borr?s
- Tribunal
- Presidente del tribunal: josep antoni Pérez pons
- isabel Bravo (vocal)
- (vocal)
- (vocal)