Tesis doctoral de Ana Fraile Escanciano
Resumen la mayoría de las plantas de cultivo son sensibles a la sal y se estima que en el año 2050 más del 50% de las tierras cultivables sufrirán problemas de salinización. Con estas consideraciones, se hace indispensable incrementar la tolerancia a la salinidad de los distintos cultivos para poder satisfacer la necesidad de producción de alimentos para una población mundial que alcanzará los 9.000 millones de habitantes. en este trabajo nos hemos propuesto esclarecer algunos de los mecanismos implicados en la tolerancia a la salinidad de las plantas. Para ello hemos elegido como planta modelo una briofita que ha resultado ser muy tolerante a la salinidad y se llama physcomitrella patens. Physcomitrella es capaz de soportar concentraciones de na+ que superan la concentración del agua del mar. Es una planta de estructura sencilla, no vascular, con una fase dominante haploide, que se puede mantener en condiciones axénicas en el laboratorio. Además, este musgo posee una alta frecuencia de recombinación homóloga lo que permite obtener mutantes por reemplazamiento génico con relativa facilidad. Todo ello, le convierte en un buen modelo para el estudio de la homeostasis iónica a nivel de planta y a nivel celular. En esta tesis se han recogido y puesto a punto varios protocolos para la manipulación in vitro, transformación y estudio de los flujos de iones en physcomitrella. en el presente trabajo nos hemos centrado en el estudio de los principales sistemas de salida de na+ de physcomitrella. La homeostasis del sodio resulta de especial interés en physcomitrella ya que es la única planta conocida hasta el momento en la que coexisten antiportadores na+/h+ tipo sos1 (ppsos1) y las bombas de na+ tipo ena (ppena1, ppena2), hasta ahora sólo identificadas en hongos y no en plantas vasculares. Recientemente, con la secuenciación del genoma completo de physcomitrella por el doe joint genome institute, hemos podido identificar otra nueva bomba tipo ena que hemos llamado ppena3 y un segundo gen sos1 que hemos llamado ppsos1b. para el estudio y la caracterización de todos estos transportadores hemos utilizado distintos sistemas de expresión heterólogos que han sido utilizados tradicionalmente como son los mutantes de levaduras, de bacterias y de arabidopsis. Sin embargo lo más novedoso de este trabajo ha sido la caracterización de estos transportadores in planta mediante la generación de mutantes de physcomitrella defectivos en sus bombas de na+ ppena1 y/o en su antiportador na+/h+ ppsos1. La generación de los mutantes ppena1, ppena1ppena2, ppsos1 y ppena1ppsos1 y su caracterización mediante ensayos de flujos de entrada y salida de na+ nos ha permitido demostrar que ppena1 es el principal sistema de salida de na+ a ph alcalino y que ppsos1 es el principal sistema de salida de na+ a ph ácido. Por otro lado, es la primera vez que se demuestra en plantas que la eliminación de un transportador sos1 conlleva la desaparición de la salida de na+ (como ocurre en los mutantes ppsos1 y ppena1ppsos1). Además hemos podido observar que en estos mutantes la exposición al na+ induce muerte celular y que, independientemente de la presencia de na+, tienen afectado el transporte de k+ de alta afinidad. Pero sin duda, una de las mayores aportaciones de este trabajo ha sido la generación de estos mutantes que podrán convertirse en una nueva herramienta muy útil para el estudio y la caracterización de otros transportadores de na+ de plantas. abstract the majority of crop plants are sensitive to salinity and it is expected that by year 2050 more than 50% of arable land will suffer from salinization problems. Considering this, it is essential to increase the salinity tolerance of different crops in order to satisfy the food production demands of a world-wide population that will reach 9,000 million people. in this work, we aim to clarify some of the mechanisms involved in salinity tolerance in plants. We have chosen as a model plant the bryophyte physcomitrella patens that was proven to be very tolerant to salinity. Physcomitrella is able to tolerate concentrations of na+ surpassing that of sea water. It is a nonvascular plant of simple structure with a dominant haploid phase that can be maintained under axenic conditions in the laboratory. In addition, this moss has a high frequency of homologous recombination thus allowing a rather simple generation of knock-out mutants. In this thesis, we have gathered and developed several protocols for the in vitro manipulation, transformation and study of the ion fluxes in physcomitrella. All this characteristics make from it a good model for the study of ionic homeostasis at both cellular and plant level. plant cells eliminate excess na+ by extruding it outside the cytosol or by sequestering it inside the vacuole. In the present work, we have focused in studying the main systems of na+ extrusion in physcomitrella. Sodium homeostasis in physcomitrella is of special interest since it is the only plant characterized until the moment in which na+/h+ antiporters type sos1 (ppsos1) and na+ pumps type ena (ppena1, ppena2) coexist which, until the present time, were only identified in fungi but not in vascular plants. Recently, with the sequencing of the complete genome of physcomitrella by the doe joint genome institute, we were able to identify another new na+ pump type ena, that we called ppena3 and also a second sos1 gene, that we called ppsos1b. for the study and characterization of these transporters we have used various routinely implemented systems of heterologous expression such as mutants of yeast, bacteria and arabidopsis. Nevertheless, the most novel part of this work is the characterization of these transporters in planta by generating physcomitrella mutants defective in na+ pump ppena1 and/or na+/h+ antiporter ppsos1. The generation and characterization of the mutants ppena1, ppena1ppena2, ppsos1 and ppena1ppsos1 by means of na+ efflux and influx assays allowed us to demonstrate that ppena1 is the main system of na+ efflux at alkaline ph while ppsos1 is the main system of na+ efflux at acidic ph. On the other hand, we have demonstrated for the first time in planta that the elimination of sos1 transporter leads to the impairment of na+ efflux (as in the case of the mutants ppsos1 and ppena1ppsos1). Moreover, we have observed that exposure of these mutants to na+ induces cell death as well as affecting their high affinity k+ transport independent of the presence or absence of na+. Indeed, one of the major contributions of this work has been the generation of these mutants that may become a new and very useful tool for the study and characterization of other na+ transporters in plants.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio de los transportadores de sodio y potasio implicados en la tolerancia a la salinidad de physcomitrella patens«
- Título de la tesis: Estudio de los transportadores de sodio y potasio implicados en la tolerancia a la salinidad de physcomitrella patens
- Autor: Ana Fraile Escanciano
- Universidad: Politécnica de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 24/11/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Begoña Benito Casado
- Tribunal
- Presidente del tribunal: alonso Rodriguez navarro
- Francisco Rubio muñoz (vocal)
- ramón Serrano salom (vocal)
- Francisco Javier Quintero toscano (vocal)