Tesis doctoral de Marta Vila Spinola
Los organismos marinos, y en particular las microalgas, son una fuente importante de infinidad de productos naturales con potenciales aplicaciones terapéuticas e industriales. Son numerosas las aplicaciones de las microalgas en producción de energía, agricultura, tratamiento de aguas residuales, obtención de compuestos químicos (pufas pigmentos, polisacáridos, proteínas, vitaminas) y compuestos terapéuticos (richmond, 2004). La calidad y funcionalidad de los aditivos alimentarios repercute en la calidad de los alimentos y en sus efectos sobre la salud, por lo que existe un creciente interés en el desarrollo de productos naturales para su uso como aditivos en alimentación humana y animal, asi como complementos nutricionales o en formulaciones cosméticas. En particular, los carotenoides presentan un especial interés por su capacidad antioxidante, colorante, provitamínica y terapéutica. Las microalgas son la principal fuente natural de un buen número de carotenoides naturales, entre los que podemos citar (3-caroteno, astaxantina o luteina, por lo que su explotación industrial para la producción de estos carotenoides está bastante extendida. No obstante el cultivo de microalgas a gran escala y su utilización para producir carotenoides no está exento de problemas. El número de carotenoides producidos industrialmente se restringe sólo a unos pocos y las productividades no son siempre tan altas como serla deseable. El conocimiento adecuado de las rutas biosintéticas, su regulación y los factores que influyen sobre ellas es fundamental para el óptimo aprovechamiento de esta incipiente tecnología. la obtención de microalgas hiperproductoras de carotenoides de interés esta siendo objeto de numerosas investigaciones a día de hoy, y desde hace algunos años. A diferencia de lo que ocurre en procariotas, en el genoma nuclear de las microalgas y otros eucariotas, el adn foráneo se integra preferentemente al azar por recombinación no homologa. Esto ha dificultado los estudios metabólicos por aproximaciones de genética reversa y ha impedido la modificación genética de las microalgas para obtener especies que acumulen mayores cantidades de metabolitos de interés mediante la inactivación selectiva de ciertos genes. con estos antecedentes nos planteamos estudiar la acumulación del fitoeno en microalgas. resumen el fitoeno es el primer carotenoides incoloro y lineal, en la ruta de ca carotenogénesis. Se forma por la condensación de dos moléculas de geranil-geranil pirofosfato, por acción de la enzima fitoeno sintasa. A partir del fitoeno se sintetizan el resto de carotenos mediante una serie de desaturaciones y delaciones; y las xantofilas por hidroxilación, oxidación o epoxidación de los correspondientes carotenoides. El paso del fitoeno a licopeno implica la acción sucesiva de dos desaturasas (pds y zds), que introducen enlaces dobles conjugados en el esqueleto carbonado del fitoeno. La enzima fitoeno desaturasa (pds) será objeto de estudio en este trabajo, ya que su inhibición supondría una acumulación de fitoeno. la capacidad de dunaliella bardawil para sintetizar (3-caroteno en respuesta a condiciones de estrés ambiental o carencias nutricionales es bien conocida. La limitación de la fuente de nitrógeno es uno de los factores nutricionales que más fuertemente induce la activación de la carotenogénesis. El herbicida piridazinonico norflurazón inhibe la fitoeno desaturasa mediante competición con sus cofactores. En la primera parte de este trabajo hemos observado mediante análisis por cromatografía liquida (hplc) que tratar células de esta microalga, sometida a carencia de nitrógeno, con norflurazon, provoca la acumulación de fitoeno, carotenoide incoloro muy apreciado en la industria cosmética, farmacéutica y alimentaria por sus propiedades antioxidantes. el uso de construcciones antisentido o la expresión de secuencias que generen pequeños rna de interferencia («sirna») ya ha sido utilizado con éxito para la supresión especifica de varios genes en chlamydomonas. En este trabajo hemos obtenido transformantes de chlamydomonas, mediante esta técnica, con bajos niveles de expresión para la fitoeno desaturasa pero que sorprendentemente no acumulan fitoeno. Esto es debido a la existencia de dos genes para esta enzima. La construcción de vectores de expresión apropiados para microalgas ha sido fundamental para conseguir la expresión de genes o construcciones en chlamydomonas, y ha permitido, mediante el uso de construcciones con genes marcadores, la selección de transformantes. Además, la utilización de promotores inducibles ha permitido aislar transformantes cuyas características adquiridas suponían letales. dado el papel de los carotenoides como antioxidantes protectores frente al daño fotooxidativo, hemos aportado también en la búsqueda de mutantes de chlamydomonas, obtenidos mediante mutagénesis insercional, sensibles a altas intensidades de luz. Esta sensibilidad se explica por la interrupción de algún gen de la ruta de carotenogénesis, obteniendo así mutantes deficiente en algún carotenoides, lo que supondría una gran susceptibilidad frente al daño fotooxidativo.
Datos académicos de la tesis doctoral «Inhibición de la enzima fitoeno desaturasa y acumulación de fitoeno en microalgas : el irna como mecanismo de silenciamiento génico«
- Título de la tesis: Inhibición de la enzima fitoeno desaturasa y acumulación de fitoeno en microalgas : el irna como mecanismo de silenciamiento génico
- Autor: Marta Vila Spinola
- Universidad: Huelva
- Fecha de lectura de la tesis: 20/03/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Rosa María León Bañares
- Tribunal
- Presidente del tribunal: emilio Fernandez reyes
- Antonio José Márquez cabeza (vocal)
- Carlos Vilchez lobato (vocal)
- aurora Galvan cejudo (vocal)