Tesis doctoral de María Lourdes Acosta Lopez
En la tecnología del cultivo de células animales, uno de los intereses mayoritarios es incrementar el rendimiento del producto mediante mejoras del proceso de producción desde sus inicios. En este sentido, la caracterización del crecimiento y el metabolismo de cualquier línea celular es esencial antes de llevar a cabo procesos a gran escala. el objetivo de este trabajo es el estudio del efecto de la concentración de diferentes nutrientes y metabolitos secundarios presentes en el medio de cultivo, así como del cultivo conjunto con linfocitos t, sobre el metabolismo y los parámetros cinéticos del hibridoma de linfocito b murino 55-6, productor de un anticuerpo monoclonal dirigido frente a la proteína gp-120 de la superficie del vih-i. con este fin, se han realizado cultivos en discontinuo en frascos t bajo diferentes condiciones, determinándose en todos ellos la concentración de células totales, xt, y viables, xv, las concentraciones de los metabolitos más importantes (glucosa, glutamina, lactato y amoniaco), y la de anticuerpo monoclonal, acmo, así como la fracción activa del acmo obtenido. para la obtención de los parámetros cinéticos se necesitó el empleo de ecuaciones empíricas que ajustasen los datos primarios o experimentales con la mayor precisión posible. De esta forma, para ajustar la variación de la concentración de células totales y viables frente al tiempo de cultivo, se seleccionó una ecuación logística asimétrica; mientras que para ajustar los datos experimentales de concentración de glucosa, glutamina, lactato, amoniaco y acmo, se empleó una ecuación sigmoidal asimétrica. Gracias a estas ecuaciones, se pudieron calcular la velocidad específica de crecimiento celular, ?, Y las velocidad específica de consumo de nutrientes (glucosa, qglc, y glutamina, qgin), de producción de metabolitos secundarios (lactato, qlac, y amoniaco, qam) y la de producción de acmo, qacmo, así como sus coeficientes de rendimiento aparentes. en primer lugar, en esta memoria se ha estudiado el efecto de la concentración de glucosa y glutamina en el medio de cultivo sobre el metabolismo del hibridoma 55-6. En estos ensayos se encuentra que para [glc]0>1,0mm y [gln]0>0,2mm, la limitación cinética desaparece, observándose un patrón de limitación del crecimiento puramente estequiométrico. Además, se ha demostrado que cuando la glutamina comienza a ser limitante, el consumo de glucosa por las células se reduce, debido a que la falta de glutamina en el medio no puede ser compensada totalmente por la glucosa, mientras que el metabolismo de la glutamina es más eficiente. En cuanto a la producción de acmo en estos ensayos, se demuestra que la formación de acmo es fundamentalmente no asociada al crecimiento, por lo que es independiente de las concentraciones de glucosa o glutamina ensayadas. Sin embargo, la fracción activa del acmo generado depende de la [glc]0, observándose que aumenta a medida que lo hace la concentración de glucosa. el transporte de la glucosa y la glutamina al interior de las células, así como las rutas de la glucólisis y la glutaminolisis, ocurren a velocidades elevadas, que dan lugar a grandes cantidades de metabolitos que actúan como inhibidores, como es el caso del lactato y el amoniaco. En esta memoria se estudia el efecto de diferentes concentraciones iniciales de amoniaco, [am]0, y de lactato, [lacjo, encontrándose que, mientras que el amoniaco reduce marcadamente el crecimiento celular por encima de concentraciones de 4,0mm, para observar un efecto inhibitorio del lactato, se deben alcanzar concentraciones diez veces superiores a las encontradas para la inhibición por el amoniaco. el efecto de la concentración de amoniaco sobre la producción de acmo está relacionado con la inhibición del crecimiento celular, de forma que la qacmo disminuye con el aumento en la [am]0. Por el contrario, cuando aumenta la [lacjo, se observa un aumento de la qacmo. Para ninguna de las concentraciones de amoniaco y de lactato ensayadas se ha encontrado efecto alguno sobre la fracción activa del acmo generado por las células. el piruvato constituye un punto central de ramificación metabólíca, siendo además clave en el metabolismo del carbono. Es por esto que se estudia el efecto de la presencia de piruvato en cultivos realizados con diferentes concentraciones iniciales de glucosa y glutamina. En ninguno de los ensayos realizados en este bloque se ha observado efecto de la concentración de piruvato sobre la ?. Cuando la concentración de glutamina en el medio es limitante, se observa que el piruvato es capaz de suplir la falta de glutamina que no es capaz de compensar la glucosa, haciendo, además, el metabolismo de la glucosa más eficiente. el suero fetal bovino, fbs, es el suplemento estándar mayoritariamente empleado en los medios de cultivo. Ayuda a mantener el crecimiento celular y la producción de anticuerpo gracias al aporte de proteínas, factores de crecimiento y otro gran número de macromoléculas. En esta memoria se ha estudiado el efecto del empleo de diferentes concentraciones de fbs, encontrándose una extraordinaria dependencia de la ? Con la proporción de fbs y un metabolismo de la glutamina y la glucosa mucho más eficiente cuando se emplean elevadas concentraciones de fbs en el medio (15%). Sin embargo, no se ha encontrado efecto alguno de la concentración de fbs ni sobre la qacmo ni sobre el yacmo/xt, así como tampoco sobre la fracción activa del acmo producido. la relación existente entre las células del sistema inmune está más que establecida. Tanto in vivo como in vitro, los linfocitos b necesitan ser activados por los linfocitos t, que, a su vez, han de estar activados previamente, para que se desencadene la respuesta inmune. Esta colaboración se obtiene a través de la interacción de diferentes moléculas efectoras, tanto unidas a la membrana (como la interacción cd4q-cd40l) como secretadas (como las interleucinas). estos fundamentos nos han servido para estudiar el efecto sobre el metabolismo del hibridoma 55-6 en cultivos conjuntos con linfocitos t el-4, encontrándose que existe cierta interacción entre ambas poblaciones celulares de manera que la ? Para las células de hibridoma es mayor cuando la relación 55-6:el-4 inicial es de 4:1, disminuyendo después a medida que aumenta la relación en linfocitos t, mientras que la ? Para los linfocitos el-4 es siempre mayor en los co-cultivos que en el cultivo control. en cuanto a la producción de acmo, se observa que qacmo aumenta en los co-cultivos con respecto al control de células 55-6, y a medida que aumenta la relación inicial de linfocitos t. Además, mientras que para los cultivos con relaciones iniciales 4:1 y 3:1 qacmo se mantiene prácticamente constante con el descenso de ? A lo largo del tiempo de cultivo, para los realizados con relaciones iniciales de 2:1 y 1:1, se observa un aumento en la qacmo cuando las células dejan de crecer sin embargo, no se observa ningún efecto sobre la fracción activa del acmo debido al cultivo conjunto de ambas líneas celulares.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio del metabolismo del hibridoma 55-6, productor de anticuerpos monoclonales contra la proteina gp-120 del vih«
- Título de la tesis: Estudio del metabolismo del hibridoma 55-6, productor de anticuerpos monoclonales contra la proteina gp-120 del vih
- Autor: María Lourdes Acosta Lopez
- Universidad: Almería
- Fecha de lectura de la tesis: 10/03/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Antonio Contreras Gomez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Fernando Camacho rubio
- sergio Martínez escobar (vocal)
- Emilio Molina grima (vocal)
- mario Diaz fernandez (vocal)