Tesis doctoral de María De Los ángeles Vidales Colinas
En estudios anteriores realizados en inbiotec, se determinó que la cepa e. Rubrum c47, aislada de la cecina, inmovilizaba y causaba la muerte de los ácaros (ortiz, j. F., Tesis doctoral, 2006). Este resultado coincidía con los obtenidos en los estudios sobre la infestación y métodos de control de los ácaros en el salami y el jamón curado realizados por rota (1972) y arnau y guerrero (1995). Se comprobó que el efecto acaricida se debía a la flavoglaucina, compuesto identificado anteriormente en el extracto crudo de micelio de aspergillus repens (eurotium repens) (podojil y col., 1979). Dicho compuesto presentaba además actividad tóxica frente a artemia salina y antibacteriana frente a bacillus subtilis (ortiz, j. F., Tesis doctoral, 2006). con el fin de estudiar la ruta de biosíntesis de flavoglaucina y desarrollar un método para el control biológico de los ácaros en el jamón y la cecina, sin que ello afecte a las características organolépticas del producto final, el primer objetivo que se planteó en este trabajo de investigación fue la obtención de cepas afectadas en la producción de flavoglaucina. Para ello la cepa e. Rubrum c47 fue sometida a un proceso de mutagénesis con nitrosoguanidina, compuesto mediante el cual se pueden obtener un gran número de mutantes con una tasa de mortalidad intermedia (diaz minguez y col., 1988). Posteriormente, mediante la técnica de cromatografía en capa fina (tlc) se realizó un primer análisis que nos permitió seleccionar de forma rápida los mutantes no-productores y superproductores de flavoglaucina. la producción de flavoglaucina en ambos tipos de mutantes se determinó posteriormente por hplc, confirmándose la obtención de dos mutantes no-productores, a313 y t3133, y un mutante superproductor, a1161, el cual produce aproximadamente tres veces más flavoglaucina que la cepa parental. los mutantes no productores fueron caracterizados morfológica y genotípicamente debido a que presentaban diferencias fenotípicas respecto al a las descritas como propias del género eurotium. La caracterización morfológica se llevó a cabo en base a las características macroscópicas y microscópicas del micelio en distintos medios de cultivo descritas por pitt y hocking (1997), pero no se consiguió determinar con exactitud la especie a la que pertenecían los mutantes no-productores. La caracterización genotípica se realizó mediante la amplificación y la secuenciación de los espaciadores intergénicos (itss) y el gen que codifica el arn ribosomal 5,8s. La variabilidad existente en estas regiones se utiliza de forma convencional como criterio de diferenciación interespecífica tanto en hongos filamentosos como en levaduras (tamura y col., 2000 y boysen y col., 2000). Mediante dicha caracterización se determinó que únicamente seis de los diez mutantes no productores analizados pertenecían a la especie e. Rubrum. De los seis mutantes seleccionados como pertenecientes a dicha especie; dos producían flavoglaucina en pequeña cantidad, uno presentaba una gran disminución en su capacidad de crecimiento y esporulación y otro resultó ser un mutante inestable que volvió a adquirir la capacidad de producir flavoglaucina, por l que dichos mutantes fueron descartados. Finalmente se seleccionaron los mutantes a313 y t3133 como no-productores de flavoglaucina para ser utilizados en experimentos posteriores. en los análisis por tlc y hplc analítico de los mutantes no-productores, a313 y t3133, se observó que existían diferencias en cuanto a la naturaleza y a la cantidad de los metabolitos secundarios producidos por cada uno de ellos. Esto sugiere que estas dos cepas tienen mutaciones que afectan a genes diferentes de la ruta de biosíntesis de flavoglaucina. Este hecho se confirmó por la complementación de ambas mutaciones en cepas productoras de flavoglaucina obtenidas como resultado de la fusión de protoplastos de a313 y t3133. Además se observó que el mutante no-productor, a313, acumulaba dos compuestos que pensamos podrían ser posibles precursores de la flavoglaucina. Estos fueron purificados y caracterizados mediante resonancia magnética nuclear y espectrometría de masas, determinándose que se trataba de la isodihidroauroglaucina y la auroglaucina. Ambos compuestos han sido descritos como metabolitos secundarios producidos por las especies aspergillus insuetus, a. Calidoustus y e. Amstelodami (gregory j. Slack y col., 2009). Tanto la isodihidroauroglaucina como la auroglaucina presentan una estructura molecular semejante a la de la flavoglaucina y a la aspergina, lo que implica que podrían ser intermediarios de la ruta de biosíntesis de flavoglaucina. Mediante ensayos in vitro con diferentes concentraciones de ambos compuestos se determinó, sin embargo, que ninguno de ellos presenta actividad acaricida. el segundo de los objetivos de este trabajo de investigación, que tenía por objeto la caracterización de los genes implicados en la ruta de biosíntesis de flavoglaucina tiene interés desde el punto de vista biotecnológico porque dicha identificación podría permitir la obtención de cepas superproductoras de sustancia acaricida mediante técnicas de mutagénesis dirigida. Esta técnica nos permitiría obtener mutantes que sólo presenten afectada la producción de flavoglaucina, porque mediante las técnicas de mutación al azar se pueden producir varias mutaciones a la vez. En el caso del mutante superproductor de flavoglaucina, e. Rubrum a1161, además de presentar alteraciones en la producción de flavoglaucina presenta una disminución de su capacidad de esporulación, lo que le hace ser incompatible para su aplicación e implantación en los jamones. como paso previo a la identificación y caracterización de los genes biosintéticos diseñamos una hipotética ruta de biosíntesis de flavoglaucina, basándonos en estudios previos sobre la síntesis de otros metabolitos secundarios con estructura policetidica y en el hecho de que los mutantes no-productores presentaban diferencias en cuanto a los metabolitos secundarios producidos. uno de estos mutantes, t3133 no produce flavoglaucina, aspergina, isodihidroglaucina y auroglaucina por lo que pensamos que podía tener una mutación en uno de los genes implicados en las etapas tempranas de la ruta biosintética. Puesto que autores como bingle y col., (1999) y schí¼mann y col., (2006) describen a la policétidosintasa como la enzima implicada en este tipo de reacciones, posiblemente este mutante tenga una mutación en un gen que codifique una policétidosintasa. por otro lado, el mutante a313 no produce flavoglaucina, ni aspergina, pero acumula auroglaucina e isodihidroauroglaucina, los cuales, como hemos dicho anteriormente, poseen una estructura química semejante a la flavoglaucina y podrían ser intermediarios de su formación. Teniendo en cuenta estos datos proponemos que este mutante podría tener una mutación en uno de los genes implicado en las etapas tardías de la ruta de biosíntesis de flavoglaucina. Dicha mutación podría ser en un gen que codificase una desaturasas, ya que algunos autores como sakai y kajiwara, (2003) describen enzimas de este tipo como las responsables de la reducción de ácidos grasos, compuestos con estructura semejante a la de los policétidos. una vez determinados los posibles tipos de genes implicados en la ruta de biosíntesis se procedió a la localización y aislamiento de cada uno de ellos a partir de la biblioteca genómica de la cepa e. Rubrum c47 construida en el fago lambda-dash ii. Para ello, y dado que no poseíamos ninguna información sobre la secuencia del genoma de e. Rubrum, se diseñaron oligonucleótidos degenerados que permitieran amplificar fragmentos de las hipotéticas desaturasa y policétidosintasa. Dicho diseño se realizó teniendo en cuenta la frecuencia del uso de codones en e. Rubrum y en especies próximas filogenéticamente y las secuencias de los dominios conservados de policétidosintasas y desaturasas en otros hongos, tal y como describen autores como schí¼mann y hertweck, (2006); linnemannstí¶ns y col, (2002); bingle y col., (1999); sakai y kajiwara, (2003); meesapyodsuk y col., (2007) y sakuradani y col., (1999). el tercero y último de los objetivos de este trabajo de investigación fue el desarrollo de un sistema de control biológico de la infestación de jamones por ácaros, mediante la implantación de la cepa productora de flavoglaucina, e. Rubrum c47 en condiciones controladas y naturales. La cepa e. Rubrum c47, forma parte de la flora fúngica que predomina en jamones y cecinas, por lo que, es una cepa que en principio puede desarrollase fácilmente y con idoneidad bajo las condiciones medio-ambientales en las que se elaboran estos embutidos. Además, al ser un microorganismo que forma parte de la flora natural del jamón y de la cecina es previsible que su implantación en dichos productos no afecte a las características organolépticas del producto final. en un primer momento se pensó en utilizar la cepa superproductora de flavoglaucina, e. Rubrum a1161, para los ensayos de implantación del hongo en jamones, pero se descartó finalmente al comprobar que tenía disminuida su capacidad de esporulación, lo que era incompatible con las condiciones fijadas para conseguir una implantación efectiva de la cepa en los jamones, que requeriría una elevada concentración de esporas. los resultados obtenidos en estos ensayos sugieren en primer lugar que el índice de grasa de los jamones parece influir en la implantación del hongo, puesto que en aquellos más grasos la implantación es prácticamente nula. La producción del compuesto acaricida in situ posiblemente puede verse afectada por la composición porcentual de grasa que presentan estos productos. Este hecho ya se había constatado en estudios anteriores (ortiz, j. F., Tesis doctoral, 2006), que determinaron que la producción de flavoglaucina y aspergina disminuía en base a la cantidad de grasa existente, debido en parte a que el crecimiento fúngico es más lento y escaso. por otro lado, mediante ensayos de inoculación de esporas de e. Rubrum c47 en condiciones controladas de temperatura y humedad se ha conseguido implantar con éxito el hongo en jamones. Además se ha observado implantación de la cepa en jamones no tratados que se encontraban en el secadero natural después del traslado allí de los jamones inoculados con el hongo. Sin embargo la implantación no es homogénea y parece depender, entre otros factores, del tipo de jamón, especialmente de su porcentaje de grasa y de su tiempo de curación. sin embargo se ha constatado que la implantación del hongo no es capaz de proteger suficientemente a los jamones de una infestación masiva de ácaros, posiblemente porque los ácaros se multiplican antes de que la sustancia acaricida producida por e. Rubrum tenga efecto y/o porque la cantidad de la misma producida in situ sobre los jamones no sea suficiente para provocar una mortalidad significativa de los ácaros. nuestros resultados permiten concluir que un control biológico efectivo de los ácaros por e. Rubrum requeriría mejorar, por una parte, la implantación del hongo en los jamones, de forma que esta sea más rápida y homogénea y sobre todo implementar la producción de la sustancia acaricida. Para ello sería de ayuda tener un mayor conocimiento y control de los distintos parámetros físicos implicados en la maduración de los jamones y de los genes implicados en la biosíntesis de flavoglaucina.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio de la ruta biosintética del acaricida flavoglaucina producido por eurotium rubrum c47, aislado natural de la cecina de león«
- Título de la tesis: Estudio de la ruta biosintética del acaricida flavoglaucina producido por eurotium rubrum c47, aislado natural de la cecina de león
- Autor: María De Los ángeles Vidales Colinas
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 04/05/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Juan Francisco Martín Martín
- Tribunal
- Presidente del tribunal: germán Larriba calle
- federico salvador Laich (vocal)
- silvia m. Albillos García (vocal)
- María dolores García cachán (vocal)