Tesis doctoral de María Isabel Marquina Rodríguez
La fosfo-defosforilación de residuos serina, treonina y tirosina es uno de los mecanismos de regulación de proteínas más extendido en los seres vivos. Este tipo de reacciones es llevado a cabo de una manera estrictamente coordinada por las proteínas quinasas y fosfatasas. El genoma de la levadura saccharomyces cerevisiae codifica un número más elevado de ser/thr quinasas que de fosfatasas. Para llevar a cabo su función biológica, algunas ser/thr fosfatasas han desarrollado una estrategia evolutiva basada en la unión a subunidades reguladoras, que determinan su localización subcelular, actividad y/o especificidad de sustrato. una de las ser/thr más estudiadas en los últimos años es la fosfatasa de tipo 1 (pp1). Esta proteína, muy conservada evolutivamente, es esencial y está involucrada en multitud de procesos biológicos diferentes, desde el metabolismo de carbohidratos hasta la regulación del ciclo celular. Tanto la ausencia como el exceso de actividad pp1 son perjudiciales para la célula, motivo por el cual esta proteína presenta una regulación extremadamente fina, presentando una multitud de subunidades reguladoras que se encargan de modular su actividad. El estudio de la unión entre diferentes subunidades reguladoras y la fosfatasa han permitido profundizar en el conocimiento de la regulación de la fosfatasa pp1. Además, han permitido identificar, entre otras, una zona presente en muchas de estas subunidades reguladoras, denominado motivo rvxf, que es necesario para la unión con la fosfatasa y que interacciona con una región hidrofóbica de pp1 situada lejos del centro catalítico de la enzima. El genoma de la levadura s. Cerevisiae contiene únicamente un gen, denominado glc7, que codifica la única isoforma catalítica de la pp1 en éste organismo. en el momento de iniciar este trabajo nuestro grupo de investigación en colaboración con el laboratorio del dr. Pascual sanz (ibv, csic, Valencia) acababa de caracterizar al primer inhibidor endógeno de la proteína fosfatasa glc7, denominándola ypi1 (yeast phosphatase inhibitor-1). Este estudio demostró que esta proteína interactúa físicamente con glc7 in vivo y es capaz de inhibir su actividad fosfatasa in vitro. La delección de ypi1 es letal, lo que indica un papel importante en la biología celular. Por ello nos planteamos estudiar los efectos fenotípicos atribuibles a un incremento de su expresión, así como la creación de mutantes condicionales (basados tanto en el uso de un degrón como en sistemas de expresión del promotor teto regulable por doxiciclina) con el fin de elucidar el mecanismo por el cual ypi1 estaría regulando algunas de las funciones esenciales de glc7. Así, observamos que las células que sobreexpresan ypi1 exhiben un fenotipo consistente con tolerancia salina, probablemente a través de la regulación de la atpasa de sodio ena1. Además, la disponibilidad de estos mutantes condicionales de ypi1 ha permitido demostrar que la función que este regulador desempeña sobre la fosfatasa glc7 está vinculada con el mantenimiento de la integridad de la pared celular. por otro lado, la falta de ypi1 resulta en un dramático bloqueo en la transición g2/m del ciclo celular, con gemas anormalmente alargadas, y spindles mitóticos cortos, aunque las bases moleculares de estos fenotipos no han sido esclarecidas por completo. Nuestros resultados recientes muestran que la ausencia de ypi1 provoca una estabilización de la securina pds1, sugiriendo una activación de los checkpoints que regulan la transición g2/m. El bloqueo en g2/m, provocado por la falta de ypi1 aún persiste en células carentes de mad1/mad2 o rad9, a pesar de que estas células carecen de componentes clave en la señalización de los checkpoints del spindle y de daño en el dna, respectivamente. En contraste, la delección de swe1, que codifica una proteína quinasa necesaria para la activación del checkpoint de la morfogénesis, permite la salida del bloqueo en g2/m del mutante ypi1 y recupera la morfología normal de las células, aunque éstas no son capaces de sobrevivir. La ausencia de ypi1 provoca una estabilización de swe1, que conlleva una persistente fosforilación de la proteína quinasa cdc28 en la tyr19, inhibiendo su actividad y bloqueando la progresión del ciclo celular. Esta secuencia de eventos son los responsables de inducir una activación del checkpoint de la morfogénesis. Además, hemos observado que la ausencia de ypi1 provoca un ensamblaje defectuoso del anillo de septinas en el cuello de la gema, pudiendo ser ésta la causa del bloqueo característico en g2/m descrito en estas células. finalmente, no se descarta la posibilidad de que la falta de ypi1 podría involucrar la activación de chekpoints adicionales, ya que la estabilización de la securina pds1 aún se observa en células teto7:ypi1 swe1, a pesar que éstas progresan a través de la mitosis. Por otro lado, la falta de ypi1 provoca una fuerte disminución en la expresión de cdc26, que codifica una subunidad del apc/c. Células carentes de cdc26 sufren un bloqueo en g2/m, con spindles anormalmente cortos, fenotipo idéntico al observado en ausencia de ypi1. La sobreexpresión de cdc26 permite que células carentes de ypi1 progresen a través de la mitosis, aunque no corrige el fenotipo de letalidad, dejando abierta la posibilidad que ypi1 podría modular la función de glc7 sobre el apc.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio funcional de ypi1, una subunidad reguladora esencial de la proteína fosfatasa glc7«
- Título de la tesis: Estudio funcional de ypi1, una subunidad reguladora esencial de la proteína fosfatasa glc7
- Autor: María Isabel Marquina Rodríguez
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 27/07/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Joaquin Ariño Carmona
- Tribunal
- Presidente del tribunal: pascual Sanz bigorra
- rosa Aligue alemany (vocal)
- (vocal)
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