Tesis doctoral de Carolina Carmen Sanchez Martin
El colesterol es una molécula indispensable para los mamíferos, pues no sólo cumple un papel estructural en las membranas biológicas y es precursor de los ácidos y sales biliares y de las hormonas esteroídicas sino que además desempeña funciones reguladoras a muy diversos niveles. El colesterol es imprescindible para la proliferación y el ciclo celular, donde no sólo es necesario para la formación de las membranas sino también para el desarrollo de la mitosis y la culminación de la citocinesis, como se ha demostrado en nuestro laboratorio. Utilizando inhibidores distales de la biosíntesis de colesterol habíamos determinado que al tiempo que las células se empobrecían en colesterol, se detenían en la fase g2/m del ciclo y, posteriormente, se formaban células poliploides. En relación con esto, y dado que los procesos de proliferación y ciclo celulares tienen una estrecha vinculación con la diferenciación celular, en el presente trabajo hemos querido ahondar en la implicación del colesterol en estos procesos. La inhibición de la biosíntesis de colesterol en células de la línea promielocítica humana hl-60, hemos demostrado que conduce a la diferenciación de estas células hacia la línea granulocítica, similarmente a como lo hace el ácido todo-trans-retinoico, con incremento del marcador de superficie cd11c y de la expresión de p47phox y p67phox, componentes la nadph oxidasa, así como de su actividad. Este efecto se correlaciona con la inhibición de la proliferación. Además, se debe específicamente a la deficiencia de colesterol, por cuanto la adición del colesterol al medio impide la expresión de aquellos marcadores de la diferenciación. Ni el farnesol ni el estigmasterol, un fitosterol análogo del colesterol, fueron capaces de prevenir o atenuar el fenómeno de diferenciación, mientras que el 7-deshidrocolesterol, el precursor biosintético inmediato del colesterol, era capaz de sustituir a éste en la proliferación y el ciclo celulares, previniendo la diferenciación. La extracción selectiva del colesterol de la membrana mediante tratamiento con metil-beta-ciclodextrina también indujo la diferenciación de estas células, pero en este caso no se activó la nadph oxidasa y algunas células expresaron también cd14, por lo que la deficiencia de colesterol en la membrana y la inhibición de la biosíntesis de colesterol, que conlleva la acumulación de ciertos intermediarios, pueden establecer diferencias en cuanto al tipo de diferenciación que se siga. En cuanto a las vías de señalización, en ambos casos la diferenciación requería la activación de la vía de erk y la inhibición de la vía de p38 mapk. Por otro lado, observamos que el tratamiento con metil-beta-ciclodextrina producía una rápida parada de la proliferación celular y un bloqueo de la citocinesis, conduciendo finalmente a la formación de células poliploides. Caracterizando las proteínas implicadas en la parada del ciclo celular en este modelo experimental constatamos que diversas proteínas de señalización esenciales para la progresión del tránsito por mitosis se encontraban disminuidas. Por último, hemos estudiado a lo largo del ciclo celular la expresión de ptc1, una proteína implicada en el desarrollo embrionario a la que se le ha asignado también un carácter de oncosupresor. Describimos por primera vez que ptc1 co-localiza con las estructuras mitóticas en diversas líneas celulares de mamíferos, y que dicha co-localización se ve alterada por la depleción celular de colesterol. cholesterol is essential for mammals, as it is required for membrane formation, it is used as metabolic precursor for the synthesis of bile acids and steroid hormones and plays regulatory actions at different levels. Cholesterol is also indispensable for cell proliferation and cell cycle progression. In our laboratory it was demonstrated that cholesterol is required for the transit through mitosis and for cytokinesis. Treatment of cells with distal cholesterol biosynthesis inhibitors, which reduced the cholesterol cell content, resulted in the accumulation of cells in g2/m phase and, eventually, the formation of polyploid cells. Given the tight relationships between proliferation and cell differentiation, we sought to determine the role of intracellular cholesterol homeostasis in these processes. We found that cholesterol biosynthesis inhibition in the human promyelocytic cell line hl-60 resulted in cell differentiation towards the granulocytic lineage, as determined by the expression of cd11c, nadph oxidase components p47phox and p67phox, as well as nadph oxidase activity. This phenotype was achieved even faster than with all-trans-retinoic acid, a prototypic cell differentiation inducer. These effects correlated with the inhibition of cell proliferation and were specifically due to the cholesterol depletion, since they were abrogated by adding cholesterol to the incubation medium. Neither farnesol nor stigmasterol, a phytosterol similar to cholesterol, was able to prevent or ameliorate the differentiation induced by cholesterol deprivation. In contrast, 7-dehydrocholesterol, the immediate biosynthetic precursor of cholesterol, was able to substitute for cholesterol in cell proliferation and cell cycle progression, thus preventing cell differentiation. The selective extraction of cholesterol from the cell membrane by means of methyl-beta-cyclodextrin, also induced hl-60 cell differentiation but, in this case, nadph oxidase activity was not stimulated and some cells expressed cd14 instead of cd11c. Therefore, selective cholesterol extraction from the cell membrane and distal inhibition of cholesterol biosynthesis, which is always accompanied by the accumulation of determined intermediate sterols, are not equivalent in inducing cell differentiation. As regards to cell signalling pathways involved in these differentiation processes, active erk and repressed p38 mapk were required in both cases. Treatment with methyl-beta-cyclodextrin also led to a rapid inhibition of both cell proliferation and cytokinesis, which was followed by polyploid cell formation. This was accompanied by important changes in the expression of cyclins and other proteins involved in the cell cycle. Finally, we studied the expression of ptc1 during the cell cycle, a protein that is involved in embryogenesis, as the receptor of hedgehog, and has been also reported to be act as an oncosuppressor. In the present work it is described for the first time that ptc1 co-localizes with several mitotic structures, as demonstrated in different cell lines. Notably, this localization is altered as a result of cholesterol depletion, which suggests an important role for this protein in mitosis.
Datos académicos de la tesis doctoral «Â¿efectos de la deficiencia experimental de colesterol sobre la diferenciación y el ciclo celular en células promielocíticas humanas hl-60¿«
- Título de la tesis: ¿efectos de la deficiencia experimental de colesterol sobre la diferenciación y el ciclo celular en células promielocíticas humanas hl-60¿
- Autor: Carolina Carmen Sanchez Martin
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 02/07/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Miguel ángel Lasunción Ripa
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Juan josé Aragón reyes
- Antonio Chiloeches galvez (vocal)
- angel Corbi lopez (vocal)
- antonia Martin hidalgo (vocal)