Tesis doctoral de Juan Francisco Martinez Blanch
Bacillus cereus es un bacilo gram positivo esporulado contaminante habitual de alimentos tanto frescos como procesados. La detección y cuantificación de este patógeno de alimentos se realiza habitualmente por técnicas culturales. Dichas técnicas consumen mucho tiempo y en ocasiones llevan a identificaciones erróneas. Como alternativa, las técnicas moleculares basadas en la pcr tienen como ventaja una mayor rapidez y seguridad en la identificación del microorganismo e incluso permiten su cuantificación mediante pcr a tiempo real (q-pcr). a partir de una colección de cepas de referencia y aislados de alimentos, identificadas previamente (fenotípicamente, iso 7932 y api-50ch/b y genotípica, isr-pcr y rapd), se determinó la presencia de genes relacionados con factores de virulencia mediante pcr convencional. El gen pc-plc se detectó en un mayor porcentaje en las cepas del «grupo b. Cereus», y dado que se encuentra en una única copia por genoma, fue seleccionado como gen diana. Se diseñaron 5 oligonucleótidos para el desarrollo de procedimientos de q-pcr en modo sybr green y taqman. Se optimizaron los parámetros de la reacción de cuantificación, y se evaluó la especificidad para «grupo b. Cereus», resultando más adecuado el procedimiento de sybr green q-pcr. A continuación se ensayó la capacidad para la detección y cuantificación en alimentos contaminados artificialmente: huevo líquido y leche en polvo infantil. Como resultado el sistema desarrollado ha demostrado su capacidad para la cuantificación de b. Cereus entre 105 y 100 ufc/ml a partir de la matriz ensayada, que corresponde al mismo nivel que el método de referencia por recuento en placa. dado que b. Cereus puede estar presente en alimentos tanto en forma vegetativa como esporulada, para su detección por pcr se abordó, asimismo el desarrollo de un protocolo para asegurar la liberación del dna a partir de esporas. Se partió de suspensiones calibradas de esporas que fueron sometidas a diferentes tratamientos: a) térmicos y b) adición de germinadores en diferentes combinaciones. Tras los tratamientos, se realizó la extracción de dna con dneasy tissue kit (qiagen) se cuantificó y se evaluó el rendimiento espectrofluorimétricamente (picogreen, invitrogen), mediante pcr convencional y sybr-green q-pcr. El tratamiento de germinación con 0,5 mm l-alanina-inosina resultó el más eficiente en suspensiones concentradas de esporas. Sin embargo, cuando se ensayó en alimentos en alimentos inoculados (104-100 esporas/ml), la extracción con dneasy tissue kit, sin necesidad de tratamientos previos, resultó satisfactorio. por último, se realizó una aproximación cuantitativa para la detección de formas viables de b. Cereus. Para ello se desarrolló un procedimiento de pcr a tiempo real con transcripción inversa (rt-q-pcr) utilizando como diana el rna mensajero del gen pc-plc, como indicador del estado de viabilidad celular. El nivel de sensibilidad obtenido por rt-q-pcr es de 30 células/reacción a partir de suspensiones celulares, y de 847 células/reacción en presencia de huevo líquido. los sistemas de q-pcr y rt-q-pcr desarrollados en este estudio han mostrado ser eficientes para detectar la presencia de miembros del «grupo b. Cereus» en alimentos, al menos al mismo nivel que el método de referencia, permitiendo además la cuantificación incluso de formas viables.
Datos académicos de la tesis doctoral «Desarrollo de metodos rapidos para el control de bacillus cereus en alimentos«
- Título de la tesis: Desarrollo de metodos rapidos para el control de bacillus cereus en alimentos
- Autor: Juan Francisco Martinez Blanch
- Universidad: Universitat de valéncia (estudi general)
- Fecha de lectura de la tesis: 12/12/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Rosa Aznar Novella
- Tribunal
- Presidente del tribunal: javier Hernández haba
- buenaventura Guamis lopez (vocal)
- david Rodriguez lazaro (vocal)
- Antonio Galvez del postigo ruiz (vocal)