Tesis doctoral de Marta Batlle Lacort
Las vigilinas son una familia de proteínas conservadas a lo largo de la evolución que han sido implicadas en dos funciones principales: la regulación de diferentes aspectos del rna y una contribución en la formación y/o mantenimiento de la heterocromatina. La disparidad de procesos en que se han visto implicadas hace difícil otorgarles una función en concreto. Por otro lado, su localización también es objeto de controversia: diferentes estudios les han asignado una localización exclusivamente nuclear, otros una localización citoplasmática asociada al retículo endoplasmático y, finalmente, también se las ha visto en los dos compartimentos celulares. En este trabajo hemos profundizado en el estudio de la localización subcelular de la vigilina de drosophila, ddp1, para poder analizar mejor su función, especialmente en relación con su contribución a la estructura y/o función de la heterocromatina. el estudio de la localización de ddp1 en diversos órganos de drosophila mediante anticuerpos, fusiones con la proteína verde fluorescente y microscopía electrónica indica que ddp1 es una proteína citoplasmática, asociada al retículo endoplasmático. Esta localización no se corresponde con trabajos anteriores en los cuales se había descrito una asociación de ddp1 a los cromosomas politénicos. La generación de un mutante nulo ddp1¿, y los estudios realizados con él, nos han permitido constatar que, en ausencia de ddp1, el anticuerpo ddp1 reconoce inespecíficamente otra proteína nuclear. los diferentes estudios funcionales realizados hasta ahora proponen, entre otras, una función de ddp1 en la formación y/o mantenimiento de la heterocromatina, que se sustenta sobretodo en la asociación de ddp1 a los cromosomas politénicos colocalizando con hp1, y en los fenotipos observados en un mutante hipomorfo descrito con anterioridad, el cual se comporta como supresor de la variegación y afecta la deposición de hp1 y me2k9h3 en el cromocentro. La localización citoplasmática de ddp1 y el descubrimiento de que la localización nuclear es causada por otra proteína nuclear reconocida inespecíficamente por el anticuerpo, nos llevó a replantearnos si los efectos observados con el mutante hipomorfo eran reales. Para ello, hemos estudiado si el nuevo mutante nulo generado ddp1¿ afecta la heterocromatina. se han analizado los efectos de la mutación ddp1¿ en un ensayo de variegación con diferentes líneas. Los resultados muestran que ddp1¿ no presenta supresión (ni aumento) de la variegación, y sugieren que los efectos descritos anteriormente con el mutante hipomorfo son indirectos. Esta hipótesis se ha confirmado expresando ectópicamente ddp1 a un gen reporter white mediante el sistema laci, donde se ha visto que ddp1 no induce el silenciamiento del gen reporter. Estos datos sugieren que ddp1 no afecta el silenciamiento de forma apreciable y que los resultados obtenidos anteriormente pueden ser debidos a efectos secundarios. Se analizó entonces la deposición de me2k9h3 y hp1 en cromosomas mutantes ddp1¿. Se observa una bajada de los niveles de me2k9h3 en el 50% de los casos (fuerte solo en un 25%), y una reducción de hp1 en los brazos eucromáticos pero no en el cromocentro también en un 50%. Estos resultados coinciden parcialmente con los observados con el mutante hipomorfo, pero la localización citoplasmática de ddp1 y los resultados obtenidos en los ensayos de pev y laci sugieren que la contribución de ddp1 a la formación de la heterocromatina es indirecta. los experimentos sugieren que la contribución de ddp1 a la formación y/o mantenimiento de la heterocromatina es indirecta, y podría estar asociada a cambios en la traducción de mrnas específicos, entre ellos mrnas implicados en la formación de la heterocromatina, como se ha sugerido para la vigilina de s. Cerevisiae, scp160. Esta hipótesis se ha validado estudiando las proteínas asociadas con ddp1 mediante la purificación de la proteína por el método tap. La purificación de complejos ha permitido identificar siete proteínas ribosomales en la fracción citoplasmática, sugiriendo que ddp1 se encuentra implicada en la traducción. los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la localización citoplasmática, la unión a ribosomas y la asociación al retículo endoplasmático rugoso, pero no la contribución a la heterocromatina son características de las vigilinas conservadas a lo largo de la evolución.
Datos académicos de la tesis doctoral «AnÁ lisi de la localització subcel.lular i propietats funcionals de ddp1, la vigilina de drosophila melanogaster«
- Título de la tesis: AnÁ lisi de la localització subcel.lular i propietats funcionals de ddp1, la vigilina de drosophila melanogaster
- Autor: Marta Batlle Lacort
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 21/10/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Ferran Azorin Marin
- Tribunal
- Presidente del tribunal: jordi Bernués martínez
- adoracion Huertas ruz (vocal)
- (vocal)
- (vocal)