Tesis doctoral de Elena Garrido Fernandez
Esta tesis es una contribución al conocimiento del síndrome de maroteux-lamy en el terreno de la genética molecular. El síndrome de maroteux-lamy o mucopolisacaridosis del tipo vi (mps vi) es una grave enfermedad hereditaria muy poco frecuente en humanos, provocada por la deficiencia de un único gen, que codifica la hidrolasa lisosómica n-acetilgalactosamino-4-sulfatasa o arilsulfatasa b (arsb). la primera publicación incluida en la tesis engloba los resultados del análisis de las mutaciones encontradas en el gen arsb de pacientes españoles y argentinos con mps vi. Se ha identificado todos los alelos responsables de la enfermedad, de los cuales 9 no han sido publicados anteriormente. Mediante estudios de rt-pcr se han obtenido evidencias de que algunas de las mutaciones podían provocar la destrucción del correspondiente transcrito mutado mediante el mecanismo de nonsense-mediated rna decay. El estudio también ofrece datos relativos a la clínica de los pacientes analizados, incluyendo la edad de diagnóstico, los principales síntomas fenotípicos y la concentración de glicosaminoglicanos totales excretados en orina, que constituyen datos importantes a la hora de intentar establecer relaciones fenotipo-fenotipo. Cumpliendo con otro de los objetivos de la tesis, se realizó el análisis haplotípico de cuatro mutaciones comunes identificadas en pacientes españoles y argentinos con mmps vi y se apuntó a un posible origen único para dichos cambios. la segunda publicación presenta los estudios de expresión y caracterización bioquímica de la mayor parte de las proteínas mutadas que no habían sido descritas con anterioridad por otros autores. Por primera vez en la bibliografía, se explicitó que el cdna mutado se había expresado en el mismo contexto haplotípico que en el paciente en relación con los dos cambios exónicos presentes en las bases de datos de snps, p.V358m y p.S384n. Ambas . Variantes se expresaron también de forma individual, siendo de especial interés los resultados obtenidos para el cambio p.S384n, que tradicionalmente se ha considerado como mutación patogénica sin que se hayan realizado estudios de expresión. El análisis bioquímica de la actividad enzimática in vitro de las proteínas mutadas se completó mediante análisis de western blot. También se realizaron estudios de inmunofluorescencia indirecta para valorar el grado de localización de la proteína arsb mutada en los lisosomas de fibroblastos de pacientes. Finalmente se realizaron estudios a nivel de rna para las mutaciones que introducen codones de parada prematuros en la secuencia codificante (sin sentido, de splicing). Mediante el tratamiento de cultivos de fibroblastos de pacientes con el inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida, se puso de manifiesto que el mecanismo de nonsense- mediated rna decay era responsable de la degradación de los transcritos portadores de cuatro de las mutaciones. el trabajo que ocupa el tercer artículo es una aproximación a una forma de terapia complementaria a la de sustitución enzimática ya establecida para los pacientes de mps vi, que se podría aplicar a los pacientes portadores de mutaciones sin sentido. Se trata del primer intento en esta enfermedad de intentar suprimir los codones de terminación prematura mediante el uso de antibióticos aminoglicósidos. Los ensayos se realizaron tanto en células transfectadas como en una línea de fibroblastos humanos. Las mutaciones escogidas permitieron ensayar la influencia del contexto nubleotídico del codón de parada en la determinación de la eficacia de la supresión de terminación. Las células se incubaron en presencia de gentamicina y se compararon los niveles de mrna y de actividad enzimática con los obtenidos en células sin tratar. Los resultados evidenciaron que, en líneas generales, el tratamiento con gentamicina para la supresión de codones sin sentido incrementa, aunque poco, la capacidad catalítica de la arsb, y que la eficacia del proceso parece depender del contexto nucleotídico.
Datos académicos de la tesis doctoral «Analisis genetico y molecular del sindrome de meroteaux-lamy«
- Título de la tesis: Analisis genetico y molecular del sindrome de meroteaux-lamy
- Autor: Elena Garrido Fernandez
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 22/02/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Daniel Grinberg Vaisman
- Tribunal
- Presidente del tribunal: susana Balcells comas
- pia Gallano petit (vocal)
- laura Gort mas (vocal)
- loreto Martorell sampol (vocal)