Tesis doctoral de Eva María Uros Gracia
Los isoprenoides son compuestos presentes en todos los seres vivos. Todos ellos provienen de unos precursores comunes, isopentenil difosfato (ipp) y su isomero dimetilalil difosfato (dmapp). Estos compuestos son sintetizados en bacterias a través de la ruta del metil eritritol fosfato (mep) exclusiva de estos organismos y de las plantas. Llos enzimas de la ruta del mep son esenciales ya que su falta de función es letal para los organismos que la presentan. Para poder estudiar esta ruta se generó en el grupo de investigación una cepa de e.Coli recombinante podía sintetizar ipp a partir de mva y que permitía que cepas con genes de la ruta mep deleccionadas pudieran sobrevivir gracias a agregar mva al medio de cultivo. Sin embargo se ha podido determinar que con cierta frecuencia existen bacterias deleccionadas en distintos genes de esta ruta que podían suprimir el fenotipo letal. En trabajos anteriores se obtuvieron cepas supresoras en los dos primero pasos de la ruta. Fue así como se desarrollaron estrategias genéticas por medio de las cuales se pudo determinar que ciertos genes que presentaban un cambio nucleotídico podían suprimir el fenotipo letal de estas cepas deleccionadas. en esta tesis se ha descrito que una cepa defectiva del primer gen de esta ruta, dxs, puede suplir el fenotipo letal con el gen acee mutado. Este gen codifica para la subunidad e1 de la piruvato deshidrogenasa (pdh). Sin embargo se ha confirmado la presencia de las mutaciones en este gen para poder suplir esta función como las descritas en trabajos anteriores e636q como en este trabajo l633r, e636g y q408r. Se han realizado estudios de actividad de estas proteínas e1-pdh mutadas observando la actividad tanto e1-pdh como dxs. En el caso del segundo enzima de la ruta, dxr, su defecto de función puede ser suplido por una mutación d296g en el gen gatc. Este gen forma parte del sistema fosfotransferasa por el cual se introduce el azúcar galactitol en la célula sin fosforilarlo. Se realizaron tanto estudios de crecimiento como intentos de expresión de esta proteína sin éxito. Para el resto de cepas defectivas no se ha conseguido obtener cepas supresoras de este fenotipo letal. Se ha descrito que estas cepas defectivas en los distintos genes de la ruta podían tras un crecimiento previo en medio líquido con mva, estas cepas podían sobrevivir en un medio líquido sin mva. Esto se observó en las cepas defectivas para el primer enzima de esta ruta. Durante este trabajo se han realizado pruebas de crecimiento de los distintos enzimas de la ruta en dichas condiciones y se determinó que todas presentaban este crecimiento únicamente en una primera fase (fase i), en un primer cultivo, sin embargo en el caso de las cepas defectivas para los dos primeros enzimas de la vía también seguían su crecimiento en la siguiente fase (fase ii). En estos cultivos de fase i se determinó realizar experimentos de espectrometría de masas (lc/ms-ms) para la detección de los intermediarios de la ruta en bacterias. Se detecta la presencia de dxp y mecpp en la fase i del cultivo de la cepa defectiva del gen dxs.
Datos académicos de la tesis doctoral «Análisis molecular de mutantes de escherichia coli resistentes al bloqueo en diferentes etapas de la ruta del metilerititrol fosfato (mep)«
- Título de la tesis: Análisis molecular de mutantes de escherichia coli resistentes al bloqueo en diferentes etapas de la ruta del metilerititrol fosfato (mep)
- Autor: Eva María Uros Gracia
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 19/06/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Albert Boronat Margosa
- Tribunal
- Presidente del tribunal: albert Ferrer prats
- rosa María Baños molina (vocal)
- (vocal)
- (vocal)