Tesis doctoral de Antía Rodríguez Villalón
Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide presentes en todos los organismos fotosintéticos y en algunas bacterias y hongos no fotosintéticos. En plantas, los carotenoides se sintetizan en todo tipo de plastos y son los precursores de importantes como el ácido abcísico (aba) y las estrigolactonas. En los cloroplastos los carotenoides desempeñan un papel esencialen la fotoprtección del aparato fotosintético mientras que en los cromoplastos se acumulan en grandes cantidades. Por el contrario, en los plastos presentes en plántulas crecidas en la oscuridad (etioplastos) y en los plastos de tejidos no fotosintéticos (leucoplastos) las cantidades que podemos encontrar de pigmentos son mucho menores. como los restantes isoprenoides, los carotenoides se sintetizan a partir del isopentenil difosfato (ipp) y su isómero el dimetilalil difosfato (dmapp). Estos precursores pueden ser sintetizados por dos vías diferentes: la vía del mevalonato (mva) y la vía del metileritrol 4-fosfato (mep), que se encuentra presente en eubacterias. Siendo la primera de localización citosólica, la primera se encuentra en todos los plastos procurando los precursores necesarios para la síntesis de carotenoides. La primera reacción de la vía del mep es la catalizada por la deoxixilulosa 5-fosfato (dxp) sintasa (dxs) que genera dxp a partir de piruvato y gliceraldehído 3-fosfato. Los precursores de naturaleza isoprenoide son canalizados hacia la vía carotenogénica por la acción de la fitoeno sintasa (psy), el enzima más importante en la regulación de la vía. El fitoeno, pigmento incoloro, se convierte a continuación en licopeno, reacción catalizada por la fitoeno desaturasa (pds) y caroteno desaturasa (zds). La ciclación del licopeno produce carotenos (como íY-carotneo) a partir del cual se generarán los derivados oxigenados, las xantófilas, como la violaxantina y la luteína. los animales no pueden sintetizar los carotenoides «de novo», pero son esenciales para la salud humana por lo que se ven obligados a obtenerlos mediante la dieta. Se ha demostrado que una dieta rica en carotenoides puede prevenir la incidencia de aparición de ciertos tipos de cáncer, enfermedades coronarias o la degeneración macular. Además de sus propiedades antioxidantes y su uso como nutracéuticos, los carotenoides tienen un gran valor industrial debido a su uso como colorantes naturales y por sus propiedades aromáticas. Diversas aproximaciones biotecnológicas han intentado incrementar los niveles de carotenoides en microorganismos y plantas. No obstante, para la producción biotecnológica de carotenoides pueda darse a gran escala, diversos factores limitantes deberán resolverse primero: i) determinar aquellos pasos limitantes en la biosíntesis de precursores, ii) la abundancia y disponibilidad de precursores en la biosíntesis de carotenoides; iii) la capacidad de almacenamiento de estos pigmentos. Además el conocimiento actual sobre la regulación de la biosíntesis de carotenoides ha sido realizado principalmente en cloroplastos y cromoplastos donde la luz juega un papel fundamental en la modulación de la actividad de los principales enzimas, sin embargo se desconoce que ocurre en los plastos de tejidos no fotosintéticos. objetivos el principal objetivo de este trabajo de tesis fue estudiar la regulación de la carotenogénesis en bacterias en los tejidos no fotosintéticos de arabidopsis thaliana. con este objetivo se llevaron a cabo dos estrategias: 1.1 mejorar la disponibilidad de precursores mediante la modificación genética de las principales vías de síntesis de precursores isoprenoides. aunque e. Coli puede ser modificada genéticamente para la producción de carotenoides, tan sólo dispone de pequeñas cantidades de precursores para la síntesis de estos pigmentos. Para determinar la influencia de la disponibilidad de ipp y dmapp en la producción de licopeno, nuestra primera estrategia fue sobreexpresar los genes de la vía del mep endógena de e. Coli. De forma consistente con numerosos estudios que habían sido realizados previamente, únicamente la sobreexpresión del gen codificante para la dxs, y aunque de forma menor pero significativa dxr y uno de los últimos enzimas de la vía del mep, la hidroximetil butenil reductasa (hdr), provocaban aumentos en la producción de licopeno en comparación con las células control (células transformadas con el vector vacío). Una estrategia alternativa fue incrementar los niveles de ipp y dmapp mediante la introducción de una vía heteróloga, la vía del mva. El operón del mva presenta todos los genes necesarios para la conversión de mva en ipp y dmapp. Cantidades crecientes de mva exógeno añadido al medio se correlacionaban linealmente con cantidades crecientes de licopeno. Dado que el fondo genético de e. Coli puede influir sustancialmente en su capacidad de producir licopeno, estudiamos la producción de licopeno en diferentes cepas. Inesperadamente, la producción de licopeno se duplicaba en una cepa alternativa, lo cual sugería que además del aporte de precursores, otros factores como la capacidad de almacenamiento deben de considerarse. No obstante, este trabajo demuestra que la disponibilidad de ipp y dmapp es un importante factor limitante en la producción de licopeno. 2.1 analizar los mecanismos moleculares que regulan la carotenogénesis, la síntesis de precursores y el papel de los carotenoides en etioplastos de plántulas de arabidopsis thaliana crecidas en la oscuridad. en arabidopsis thaliana, la biosíntesis de carotenoides está fuertemente activada cuando las plántulas pasan de germinar en la oscuridad (escotomorfogénesis) a un metabolismo con luz (fotomorfogénesis). Además de cambios morfológicos en la planta, la fotomorfogéneis provoca la transformación de los etioplastos en cloroplastos. Los carotenoides presentes en los etioplastos (luteína y violaxantina como componentes mayoritarios), se encuentran asociados al cuerpo prolamelar (plb) y se cree que están involucrados en facilitar el acúmulo de clorofilas después de la iluminación. No obstante, nosotros descubrimos que la carotenogénesis se induce cuando la fotomorfogénesis se activa incluso en ausencia de luz. Este incremento en la tasa biosintética en las condiciones que acabamos de citar se correlaciona con un aumento en la actividad de la fitoeno sitnasa (psy). El aumento en su actividad es debido a un aumento en los niveles de tránscritos del gen psy. Líneas transgénicas de arabidopsis que presentaban el gen reportero gus-gfp bajo el control del promotor del gen psy, mostraron que la mayor expresión génica se encontraba en los cotiledones (lugar donde se encuentran los mayores niveles de carotenoides en plántulas etioladas). Además vimos que únicamente induciendo la expresión del gen bacteriano fitoeno sintasa (crtb), observamos que se producía un aumento en los niveles de carotenoides, lo cual no ocurría en plántulas crecidas en luz. Un aumento en la producción de carotenoides parecía implicar un aumento en los niveles de precursores. Sin embargo cuando analizamos los niveles de tránscritos de los genes de la vía mep vimos que permanecían inaleterados con la desrepresión de la fotomorfogénesis. No obstante, se producía un acúmulo proteico de los principales enzimas de la vía del mep, dxs y dxr. A diferencia de lo que ocurre en luz, la sobreexpresión de dxs en plántulas crecidas en la oscuridad no provoca un aumento en la acumulación de carotenoides. Este hecho sugiere que la actividad del gen psy más que la disponibilidad de precursores, es suficiente para aumentar la síntesis de estos compuestos. Sorprendentemente, vimos que al inducir únicamente la actividad psy en nuestras líneas transgénicas para el gen crtb, se producía una acumulación post-transcripcional de la proteína dxs. Estos resultados sugieren que psy es el enzima clave en el control de la biosíntesis de carotenoides en etioplastos durante la desrepresión de la fotomorfogénesis. Se deduce también que la actividad de psy de algún modo ejerce un control en los precursores derivados de la vía mep mediante un incremento en los niveles proteicos de dxs por un mecanismo post-transcripcional que por el momento desconocemos. Estos datos sugieren que la inducción de la biosíntesis de carotenoides en etioplastos como resultado de una activación del gen psy debe tratarse de un mecanismo que facilite la adaptación al metabolismo fotosintético por parte de las plantas. 2.2 analizar la distribución espacial de la biosíntesis de carotenoides en leucoplastos de raíces y flores además de su posible función como precursores de hormonas como aba o estrigolactonas para optimizar la producción biotecnológica de carotenoides en plantas modificadas se requiere el conocimiento de dos aspectos fundamentales: la distribución espacial de los carotenoides y de los enzimas principales que modulan la actividad de sus enzimas biosintéticos. Aunque ambos aspectos se conocen en cloro y cromoplastos, poco se sabe acerca de lo que ocurre en los plastos de los tejidos no fotosintéticos. con objeto de descubrir la distribución de los carotenoides en los órganos y tejidos de arabidopsis thaliana, se realizó un análisis espacial de carotenoides empleando la microespectroscopía raman y la cromatografía líquida de alta presión (hplc). Ambas técnicas complementarias demostraron que los carotenoides se acumulaban mayoritariamente en tejido fotosintético, especialmente en hojas jóvenes y cotiledones, posiblemente debido al papel fotoprotecto de estos pigmentos. No obstante, pese a los bajos niveles de carotenoides detectados en raíces y flores, un análisis de los tránscritos de psy demostró la expresión de este gen en raíces aunque a niveles inferiores que en los tejidos fotosintéticos. Líneas transgénicas que presentaban el gen reportero gus-gfp bajo el control del promotor del gen psy nos permitieron llevar a cabo un profundo análisis del patrón de expresión de psy. Sorprendentemente, la expresión del gen reportero se localizaba en los haces vasculares de pétalos y raíces, y presentaba sus máximos niveles de expresión en tejidos fotosintético, especialmente en los estomas de las hojas y en las hojas jóvenes. Para entender el por qué de la expresión de psy en los haces vasculares de tejidos no fotosintéticos, se llevaron a cabo análisis de hibridación in situ de flores y raíces estos experimentos se complementaron con análisis por microscopía confocal y tinción histoquímica gus de secciones ortogonales de raíz. Centrándonos en el patrón de expresión de la raíz, descubrimos que la expresión de gfp y de gus se localizaba en las céulas del floema, lo cual sugería que la síntesis de carotenoides en haces vasculares radiculares podría estar respondiendo a la necesidad de precursores para la síntesis de aba. Esta hipótesis se vería reforzada por publicaciones recientes donde una isoforma tejido específica de psy en raíz existe en maíz y arroz y se induce en presencia de estres mediado por aba. Además de su papel como precursores de aba, los carotenoides han sido descritos recientemente como precursores de estrigoalctonas, implicados en diversos procesos de señalización o regulación de la arquitectura de la planta. Para investigar un poco más sobre la posible función que podrían tener los carotenoides en los haces vasculares de la raíz y su posible implicación en la síntesis de hormonas como aba y estrigolactonas, decidimos bloquear la síntesis de carotenoides únicamente en el tejidos radicular. La adición al medio de norflurazón (nfz) un inhibidor de la actividad de la fitoeno desaturasa (pds), inhibe completamente la producción de carotenoides. No obstante, la actividad de una fitoeno sintasa bacteriana (crti) aparentemente no se ve afectada por este inhibidor químico. Aprovechando este hecho, generamos líneas transgénicas para este transgén bacteriano, crti bajo el control de dos promotores diferentes de expresión únicamente aérea. En las plantas paéreo: :crti la biosíntesis de carotenoides se producía únicamente en tejidos aéreos mientras que la carotenogénesis radicular se veía bloqueada únicamente en presencia de nfz. De este modo al crecer las plantas con este inhibidor químico podríamos determinar el papel que desempeñarían los carotenoides en la arquitectura de la planta provocando alteraciones en el fenotipo y aclarando su posible implicación en la síntesis radicular de aba. Datos preliminares hasta el momento han demostrado que la expresión del transgén se encuentra mayoritariamente restringida al tejido aéreo. Estudios posteriores confirmarán los datos obtenidos hasta el momento donde se observa que las líneas transgénicas presentan un fenotipo similar a los mutante aba1-1 cuando son crecidas en presencia de nfz y bajo condiciones de estrés salino. Además alteraciones en la longitud de la raíz igual que la presencia de un ligero fenotipo de branching podrían apuntar hacia la implicación de los carotenoides radiculares en la biosíntesis de aba y estrigolactonas. No obstante, se requiere un estudio mucho más profundo para poder confirmar todos estos datos.
Datos académicos de la tesis doctoral «Biosíntesis de carotenoides en escherichia coli y en tejidos no fotosintéticos de arabidopsis thaliana«
- Título de la tesis: Biosíntesis de carotenoides en escherichia coli y en tejidos no fotosintéticos de arabidopsis thaliana
- Autor: Antía Rodríguez Villalón
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 20/05/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Manuel Rodriguez Concepcion
- Tribunal
- Presidente del tribunal: albert Boronat margosa
- María Jesús Rodrigo esteve (vocal)
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