Tesis doctoral de Cristina Bofill Bosch
La tesis que lleva por título comprehensive analysis of pseudomonas sp. 42a2 lipa and lipc lipases se enmarca en los objetivos generales de nuestro grupo de investigación, que consisten en el aislamiento, caracterización y producción de enzimas con interés biotecnológico. En este contexto, la presente tesis doctoral forma parte del proyecto global que tiene como objetivo el desarrollo alternativo de emulsionantes poliméricos para ser utilizados en la industria alimentaria. la cepa bacteriana pseudomonas sp. 42a2 transforma secuencialmente, por acción de varias enzimas, el ácido oleico en derivados hidroxilados, que serán polimerizados posteriormente por acción de una o varias lipasas en estólidos (poliésters de ácidos grasos con gran interés biotecnológico). Por ese motivo, la presente tesis doctoral se centró en el aislamiento, la clonación y la caracterización de las lipasas extracelulares lipa y lipc de la cepa pseudomonas sp. 42a2. Incluyendo el análisis de la regulación génica de ambas enzimas y la optimización de sus propiedades bioquímicas mediante el uso de técnicas en evolución dirigida. a partir del estudio del sistema lipolítico de la cepa pseudomonas sp. 42a2 se identificaron y se aislaron dos genes codificantes lipa y lipc-. Ambos genes se clonaron en la propia cepa parental y se procedió a la purificación y caracterización de las dos lipasas. Lipa y lipc presentaron diferentes propiedades bioquímicas y fisiológicas que les confieren distintos roles en la célula. Por un lado, lipa mostró un carácter mesófilo, preferencia por substratos de cadena mediana e inhibición por la presencia de aceite de oliva. Por el contrario, lipc es una enzima psicrófila, con capacidad de adaptación a distintos substratos en función de cambios de temperatura, gran tolerancia a iones pesados y con activación en presencia de aceite de oliva. A parte, se estudió la producción de lipa y lipc de pseudomonas sp. 42a2 en situación de estrés nutritivo, observando un incremento solo de la actividad de lipc. Ambas enzimas se clonaron en los huéspedes heterólogos e. Coli y bacillus subtilis juntamente con la chaperona liph, necesaria para el correcto plegamiento de las dos proteínas y por lo tanto para obtener la forma enzimáticamente activa. Sin embargo, la actividad lipolítica detectada en los clones recombinantes obtenidos fue siempre mucho menor comparada con la actividad de la cepa parental. Siendo necesario la clonación de los dos genes por separado (lipasa/foldasa) y realizar el plegamiento de la enzima in vitro. Para intentar mejorar la clonación de lipa en huéspedes heterólogos, se procedió a la obtención de una variante de lipa independiente de foldasa mediante técnicas de evolución dirigida. Sin embargo, las distintas técnicas empleadas no fueron suficientes para obtener dicha variante, significando que lipa presenta una elevada especificidad y necesidad de liph. A parte, se realizó la mejora de la termoestabilidad de lipc mediante diseño racional y evolución dirigida, obteniendo 10 potenciales variantes enzimáticas con más resistencia a la temperatura que la enzima parental.
Datos académicos de la tesis doctoral «Comprehensive analysis of pseudomonas sp. 42a2 lipa and lipc lipases«
- Título de la tesis: Comprehensive analysis of pseudomonas sp. 42a2 lipa and lipc lipases
- Autor: Cristina Bofill Bosch
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 24/03/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Pilar Diaz Lucea
- Tribunal
- Presidente del tribunal: María Jesús Martinez hernandez
- marina Lotti (vocal)
- (vocal)
- (vocal)