Tesis doctoral de Carlos Casasnovas Pons
Antecedentes: la enfermedad de charcot marie tooth (cmt) es una de las enfermedades neurologicas hereditarias más frecuentes, con una preValencia de 1/2500. Se divide en formas desmielinizantes (cmt1) con velocidades de conducción nerviosa (vcn) disminuidas, formas axonales (cmt2) y formas con velocidades de conducción intermedias. En dsitintos estudios se sugiere que la causa más frecuente de enfermedad de cmt asociada a vcn en el rango intermedio, es la tipo cmtx1, causada por mutaciones en el gen gjb-1 y se trasmite ligada a x. Así como que la causa más frecuente de la forma axonal de cmt es la debida a mutaciones en el gen mfn2 y se trasmite de forma autosómico dominante. hipótesis: la presencia de mutaciones en los genes gjb-1 y mfn2 podrían también ser la causa más frecuente de cmt con vcn intermedias y cmt axonal respectivamente en la población española. objetivos: el objetivo de los estudios es analizar la presencia de mutaciones en los genes gjb1 y mfn2 en dos cohortes de pacientes, una con cmt con formas intermedias o con sospecha de transmisión ligada a x y otra cohorte con cmt con forma axonal. Con ello, establecer la verdadera incidencia de estas mutaciones en la población española, buscar mutaciones no previamente descritas y estudiar la relación entre las mutaciones encontradas y las características clínicas. metodos: 1. Estudio gjb-1: 498 familias remitidas a centro de diagnóstico genético con sospecha de cmt y herencia dominante sin transmisión varón-varón o esporádicas. Las 106 familias en que el ssca mostró una migración anormal del dna se secuenciaron de forma directa. 2. 85 familias fueron incluida en la cohorte de sospecha de cmt axonal. Se secuenció de forma directa los 19 exones del gen mfn2. resultados: 1. Encontramos 34 familias (59 pacientes) con mutaciones en el gen gjb-1. Los estudios electrofisiológicos mostraron que el 73.5% presentaban vcn lentas o intermedias. Encontramos 6 mutaciones no descritas previamente. 2. En las familias con cmt axonal encontramos 14 pacientes pertenecientes a 14 familias con 9 mutaciones distintas del gen mfn2. La mutación arg468his es la más frecuente. Encontramos 4 mutaciones no descritas previamente. introducción las neuropatías hereditarias son trastornos que afectan a los nervios periféricos. La forma más frecuente es la neuropatías hereditarias sensitivo-motoras (nhsm) o enfermedad de charcot-marie.Tooth (cmt). Tiene una preValencia según la región de 10-30/100000. Constituye un grupo genéticamente heterogéneo de enfermedades que afectan el sistema nervioso periférico se divide en subtipos en función de los hallazgos electrofisiológicos y/o patológicos, el patrón de herencia y según el gen mutado que causa la enfermedad. Esta clasificación del cmt es compleja y está en revisión contínua conforme se descubren nuevos genes y mutaciones clasificación de la enfermedad de cmt la clasificación más frecuentemente empleada combina los hallazgos clínicos, junto con el patrón de herencia (autosómico dominante, autosómico recesivo o ligadas a x) y los hallazgos electrofisiológicos o de anatomía patológica (axonal o desmielinizante). Las formas desmielinizantes se caracterizan por afectación predominantemente de la vaina de mielina que rodea al axón del nervio periférico. La función principal de la mielina es la de aumentar la eficiencia de la velocidad de conducción nerviosa, por tanto, el hallazgo más llamativo en los estudios electrofisiológicos será el de velocidades de conducción nerviosas bajas. Las formas axonales se deben a la propia afectación del axón, en los estudios neurofisiológicos se evidenciará unas velocidades de conducción nerviosas conservadas y la amplitud de los potenciales (que reflejan fielmente la conservación de axón) estará severamente disminuida. Posteriormente se han descrito variantes que combinan tanto la afectación de la mielina como la del axón, y que por tanto, tienen velocidades de conducción intermedias, muchas de estas variantes tienen una transmisión ligada a x. combinando estos datos, podemos distinguir distintas categorías principales. La mayoría de casos se pueden incluir en los tipos cmt 1 (formas desmielinizantes, es decir con velocidades de conducción bajas, y con transmisión de herencia autosómico dominante), tipo cmt 2 (axonal y con patrón de herencia dominante la mayoría de veces dominante). Cada uno de estos tipos se puede a su vez dividir en subtipos, dependiendo del defecto molecular subyacente que lo produce. Sin embargo, cabe destacar que puede no existir buena correlación genotipo-fenotipo y que existe gran variabilidad inter e intrafamilar en la expresividad clínica . objetivos e hipotesis 1. Objetivos analizar la presencia de mutaciones en los genes gjb1 y mfn2 en dos cohortes grandes de pacientes con sospecha clínica y electrofisiológica de enfermedad de cmt. la primera cohorte, con pacientes de origen español y portugués, con herencia compatible ligada a x y la segunda cohorte, formada por pacientes de origen español y con formas axonales de cmt. Todo ello para poder establecer: 1. La incidencia de mutaciones en los genes gjb-1 y mfn2 en pacientes con cmt con posible herencia ligada a x y cmt axonal de la población española 2. Buscar mutaciones no previamente descritas en esos dos genes y establecer su valor patogénico 3. Estudio de la relación entre las mutaciones encontradas y las características clínicas y electrofisiológicas de la enfermedad. 4. Estas tres primeros objetivos ayudarán, de forma secundaria a diseñar protocolos diagnósticos eficientes de cmt en nuestra población en base a las verdaderas frecuencias de mutaciones en nuestro medio 5. Averiguar las regiones del dna donde se encuentren más mutaciones, lo que podría sugerir que esas regiones codifican para los dominios funcionalmente más importantes de la proteína y así profundizar en el conocimiento de su función (conexina 32 y mitofusina 2) y la fisiopatología general del cmt. 2. Hipótesis 1. En la población española, las mutaciones del gen gjb-1 son la causa más frecuente de cmt en pacientes pertenecientes a familias con patrón de herencia sospechoso de ser ligado a x. 2. Las regiones que con más frecuencia se encuentran mutaciones son los dominios extracelulares que son las zonas funcionalmente más importantes de la conexina 32. 3. En la población española, las mutaciones en el gen mfn2 son la causa más frecuente de cmt axonal o cmt2. 4. Las regiones que con más frecuencia se encuentran mutaciones son el dominio gtpasa o las regiones adyacentes a él. material y metodos pacientes a partir de las familias enviadas al centro de investigación de enfermedades hereditarias de idibell desde 1994 hasta 2006 se seleccionaron dos cohortes de pacientes. Todos los pacientes presentaban una neuropatía sensitivo-motora con fenotipo cmt. una cohorte está formada por los familias presentaban una herencia dominante sin transmisión varón-varón y los casos esporádicos o sin herencia conocida (498 familias) la segunda cohorte esta formada por pacientes con herencia dominante o esporádica con evidencia de neuropatía axonal en los estudios electrofisiológicos (85 familias). los estudios clínicos y electrofisiológicos se relaizaron en la unidad de neuromuscular del servicio de neurología del hospital universitario de bellvitge y en los centros de origen. estudios genéticos desde 1995 a 2006, 1090 familias con sospecha de cmt fueron referidas al centro de diagnóstico genético y molecular de enfermedades hereditarias. El dna fue aislado desde leucocitos de todos los miembros de la familia mediante un kit wizard promega. el estudio molecular primero descarto la presencia de la duplicación de 1.4-mb causa del cmt1a mediante estudio de microsatelites usando los marcadores localizados en esa región y analisis de southern blot. Para la primera cohorte los dos exones del gen gjb-1 de l propositus de cada familia se amplificaron mediante pcr. El producto de la amplificación del exon codificante 2 se estudio mediante ssca (single-strand conformation analysis) en busca de patrones de migración anormal del dna. Las 106 familias en que se encontro un patron anormal de la migración del dna en la electroforesis, se secuenciaron de forma directa. En la segunda cohorte se secuenciaron de forma directa todos los exones del gen mfn2 y proteina de la mielina cero en todas las familias, gjb1 en las familias con herencia dominante sin transmisión varón-varón y casos esporádicos, y el gen gdap1 en los casos esporádicos. Los primers usados en las pcr y sus condiciones ya estaban previemente descritos. Las muestras de dna amplificado fueron secuenciados de forma diresta usando el kit bigdye terminator reaction (applied biosystems, foster city, ca), y posteriormente usando un secuenciador abiprism 3100 (applied biosystems). los estudios poblacionales caso-control se realizaron con 100 alelos procedentes de 50 controles anonimos. En la segunda cohorte además se emplearon 60 alelos procedentes de 30 controles sanos clínica y electrofisiologicamente. estudios funcionales se cultivan fibroblastos procedentes de piel de un paciente con la mutación más prevalente. Los parametros respiratorios se mediran con distintos sustratos dependiendo del complejo respiratorio mediante un respirómetro oxygraph de alta resolución de dos canales (oroboros instruments, innsbruck, austria). Se medirá la eficiencia de producción de atp mitocondrial así como la actividad enzimática de la cadena mitocondrial. El estudio structural de la red mitocondrial se realizará segun las condiciones descritas previamente estudios estadisticos el test de mann whitney y la chi cuadrado se emplearan para las comparaciones estadisticas de los estudios funcionales y clínico-genéticos respectivamente. El 95% de intervalo de confianza (p) se obtiene usando la fórmula: p±z0.95 s, donde z0.95=1.96; q=1p; s=(pq/n)1/2 resultados los resultados de los estudios así como su discussión se encuentran explicados en: 1. Casasnovas c*, banchs i*, corral j, martínez-matos ja, volpini v. Clinical and molecular analysis of x-linked charcot-marie-tooth disease type 1 in spanish population. Clin genet. 2006 dec;70(6):516-23. * co-autores al mismo nivel de contribución 2. Banchs i, casasnovas c, montero j, martínez-matos ja, volpini v. Two spanish families with charcot-marie-tooth type 2a: clinical, electrophysiological and molecular findings. Neuromuscul disord. 2008 dec;18(12):974-8. 3. Casasnovas c, banchs i, cassereau j, gueguen n, chevrollier a, martínez-matos ja, bonneau d, volpini v. Phenotypic spectrum of mfn2 mutations in the spanish population. J med genet j med genet. 2009 nov 3. [Epub ahead of print] 4. Banchs i*, casasnovas c*, albertí a, de jorge l, povedano m, montero j, martínez-matos ja, volpini v. Diagnosis of charcot-marie-tooth disease. J biomed biotechnol. 2009;2009:985415. Epub 2009 oct 8 * co-autores al mismo nivel de contribución en la cohorte de estudio de gjb1-1 se encontrarón 34 familias (un total de 59) pacientes con mutaciones en el gen gjb-1. 28 de ellas estaban previamante descritas y 6 eran no descritas (leu39fs, glu47gly, his153fs, cys179tyr, cys201phe, ser211fs). 31 familias presentaban mutaciones puntuales de tipo missense, 2 familias presentaban la deleción de un nucleótido y una familia la deleción de dos nucleotides. En 31 familias, estos cambios producirán, a nivel de proteina, un cambio de aminoacido y en tres familias una alteración de la pauta de lectura que conllevará a la aparición de un codon de stop prematuro. 58.8 % de los probandos de esas 34 familias presentaban vcn en los estudios electrofisiológicos en el rango desmielinizante y 14.7 % ncv en el rango intermedio. Los dominios extracelulares de la proteina estaban afectados en el 64.6% (44% ec2 y 20.6% ec1). El codon 164 es el más frecuentemente afectado (10 familias). Todos los pacientes con mutaciones en el gen gjb-1, presentaban una neuropatía sensitivomotora con vcn en el rango inmtermedio o desmielinizantte en el 84% de las familias. Los varones afectos tenian una neuropatía de mayor severidad que las mujeres afectas dentro de la misma familia. en la segunda cohorte, 39 de las 85 familias (45.8%) tenian herencia dominante conocidas. Treinta y dos familias tenian sintomas leves, 29 (34%) presentaban sintomas moderados y 10 (11.7%) presentaban sintomas severos. Se detectaron 24 pacientes procedentes de 14 familias distintas con 9 mutaciones distintas del gen mfn2. Todas las mutaciones se encontraron en heterozigosis. Cuatro de las mutaciones no estaban previemente descritas (ile203met, asn252lys, gln276his, and met376val). La muatción arg94gln presenta su inicio en la primera decada de la vida. Los dos miembros afectos de la familia presentaban atrofia óptica. El estudio de resonancia magnética en uno de los pacientes mostraba minima captación de contraste en el nervio óptico sin evidencia de otrras lesions de esustancia blanca. Otras dos familias en nuestro estudio tienen una neuropatía severa la familia cmt-560 (que presenta la mutación asn252lys). La familia cmt-364 presenta la mutación met376val. En ellas, los dos miembros afectos de la familia presntaron el inicio de los sintomas en la tercera década de vida. La familia con la tampoco previamente descrta mutación ile203met, en ella, los miembros afectos iniciaban los sintomas en la segunda década y con temblor de intención. Las mutaciones previmente reportadas, gly298arg y arg364gln, y la previamante no descritas, gln276his y met376val, presentan cmt2 puro sin otros rasgos clínicos adicionales. Los miembros afectos de estas familias presentaban el inicio de la clínica entre la segunda y tercera década de vida y presentaban neuropatía entre leve y moderado. Estos cambios se encontraban, a nivel de la proteina, en el dominio funcionalmente más importante, el dynamin-like gtpase o inmendiamnete adyacente a él, respectivamante. El cambio mas frecuentemente identificado fue el arg468his. Este cambio se encontró en 6 de las familias con mutaciones de mfn2 (42.8%). No se encontraron cambios patológicos en la mfn2 en los 5 casos esporádicos de cmt2 y retraso mental ni en los dos casos esorádicos de cmt2 y neuromiotonía. Se realizó un estudio funcional de las mitocondrias en fibroblastos cultivados a partir de biopsia de piel de un paciente con la mutación arg468his, la más prevalente. Es estudio mostro los resultados típicos ya descritos en pacientes con mustaciones en la mfn2, consisitentes en una disminución de la eficiencia en la síntesis de atp y un cambio en el equilibrio el el uso de los distintos sustratos en los complejos de la cadena mitocondrial. conclusiones 1. Se han encontrado un total de 59 pacientes procedentes de 34 familias con mutaciones distintas en el gen gjb-1 y hallamos 24 pacientes pertenecientes a 14 familias con 9 mutaciones distintas del gen mfn2. Estos son los estudios de diagnóstico de mutaciones en los genes gjb-1 y mfn2, como causa de los dos subtipos de cmt, que incluyen el mayor número de familias publicadas en la literatura. 2. Se confirma la presencia de las mutaciones de cx32 como la segunda causa de cmt con velocidades intermedias o bajas en nuestra población ya que el 6,8% de las familias estudias presentan mutaciones en el gen gjb-1. 3. Se confirma que el cmt2a es la causa más frecuente de cmt2 también en nuestro medio ya que el 16,0 +/- 7,7 % de las familias con cmt2 estudiadas tienen mutaciones en el gen mfn2. El 30,0 +/- 14,2 % presentaban mutaciones si se consideran únicamente las familias con herencia dominante conocida 4. La rentabilidad del estudio del gen mfn2 en familias con cmt axonal es mayor en familias con neuropatía grave y herencia dominante conocida. En 3 de las 5 familias (60%) se hallaron mutaciones. 5. Los estudios electrofisiológicos en los probandos de las familias con mutaciones del gen gjb-1 ponen de manifiesto que el 73.5% de ellos presentaban vcn lentas o intermedias. 6. Los dominios extracelulares de la cx32 son los que con más frecuencia presentan mutaciones. Un 64.6% de las familias del estudio tiene la mutación en alguno de estos dominios (44% en ec2 y 20.6% en el ec1). 7. El dominio ec2 es la región de la cx32 más sensible a aceptar mutaciones lo que podría sugerir que se trataría de la zona de la unión tipo gap más importante desde el punto de vista funcional. 8. El codón 164 del gen gjb-1 sería una zona del dna que podría ser considerado un hot spot para mutaciones. 9. Describimos 6 mutaciones no descritas previamente en el gen gjb-1: leu39fs, glu47gly, his153fs, cys179tyr, cys201phe y ser211fs y 5 mutaciones no descritas en el gen mfn2 : ile203met , asn252lys, gln276his, arg364gln y met376val 10. La mutación arg94gln de la mfn2 se describe como causa de cmt2 también con atrofia óptica. 11. La mutación arg468his de la mfn2 es la causa más frecuente de cmt2a en nuestro medio. Los estudios poblacionales y bioenergéticos confirman su valor patógeno o que representa, al menos, un factor de riesgo heredado importante para el desarrollo de neuropatía sensitivo motora axonal. 12. Se reportan dos polimorfismos descritos previamente en la literatura del gen gjb-1 y el mayor numero de polimorfismos reportados hasta la fecha del gen mfn2. 13. El conocimiento adquirido permite aportar el diseño de protocolos diagnósticos más eficientes para la práctica clínica en nuestra población. Se ha elaborado en base a las verdaderas frecuencias de mutaciones en nuestro medio.
Datos académicos de la tesis doctoral «Enfermedad de charcot-marie-tooth: estudio clñinico y molecular de los genes gjb-1 y mfn2 en la población española«
- Título de la tesis: Enfermedad de charcot-marie-tooth: estudio clñinico y molecular de los genes gjb-1 y mfn2 en la población española
- Autor: Carlos Casasnovas Pons
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 13/04/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Victor Volpini Bertrán
- Tribunal
- Presidente del tribunal: José angel Berciano blanco
- francesc Palau martínez (vocal)
- (vocal)
- (vocal)