Tesis doctoral de Ma. Jesús Sánchez Martín
El virus c (gbv-c) o virus de la hepatitis g (hgv) está relacionado con el virus de la hepatitis c (hcv) ya que tiene una organización genómica y una homología en la secuencia muy próxima pero, sin embargo, no parece causar hepatitis ni ningún otro tipo de patología. En los últimos años, se han publicado numerosos trabajos en los que se asocia la co-infección del gbv-c/hgv y el virus de la inmunodeficiencia humana (vih) con una menor progresión de la enfermedad causada por el virus vih así como con una mayor supervivencia de los pacientes una vez que el sida se ha desarrollado. teniendo en cuenta el posible uso de los péptidos sintéticos, el objetivo de la actual tesis doctoral es llevar a cabo la selección de péptidos de la proteína de envoltura e1 del gbv-c/hgv con potencial capacidad de inhibición del péptido de fusión del vih-1 (pf vih-1), mediante la síntesis múltiple en paralelo de secuencias peptídicas lineales que cubren la totalidad de la estructura primaria de esta proteína y su posterior evaluación mediante ensayos biofísicos. Con ello se pretende plantear la utilización de péptidos sintéticos del gbv-c/hgv, tanto en la mejora de los sistemas de diagnóstico de la infección causada por este virus como en el diseño de inhibidores de la entrada del vih en la célula huésped. Se pretende así tratar de comprender mejor el efecto de la presencia de anticuerpos anti-gbv-c/hgv en la progresión de la enfermedad causada por la infección del vih y de profundizar en el conocimiento actual acerca de la interacción entre estos dos virus. inicialmente, se sintetizó el péptido e1(145-162) (w-k-v-p-f-d-f-w-r-g-v-i-s-l-t-p-l-l) ya que se definió como posible región antigénica según los perfiles de hidrofilicidad y accesibilidad de acuerdo con janin, hopp y woods y fraga. este péptido se caracterizó fisicoquímicamente estudiando su interacción con modelos de membrana. Su habilidad para inducir perturbaciones en modelos de membrana se analizó monitorizando el comportamiento del péptido en presencia de diferentes concentraciones de lípido y a diferentes temperaturas. Diferentes series de experimentos basados en el espectro de emisión de fluorescencia del triptófano, se llevaron a cabo midiendo el espectro de emisión en función de la concentración de lípido. Por otro lado, se caracterizó fisicoquímicamente la secuencia peptídica estudiando su interacción con monocapas lipídicas, usadas como modelos de membrana, de dmpc y dmpg. Estas monocapas se examinaron mediante microscopia de ángulo de brewster (bam). posteriormente, se ha llevó a cabo la síntesis múltiple en paralelo de los péptidos en fase sólida utilizando un sintetizador semiautomático (multisyntech gmbh). Se sintetizaron 58 péptidos solapados cada 3 residuos correspondientes a la proteína de envoltura e1, los cuales se nombraron desde p1 a p58. Y se realizó el ensayo de liberación de contenidos vesiculares como primer test para la determinación de la potencial capacidad fusogénica por parte de los péptidos sintetizados. Además se realizó el mismo ensayo también con el péptido de fusión de la glicoproteína gp41 del vih (vih-1 fp) para evaluar la capacidad de los péptidos del gbv-c/hgv de inhibir la actividad del péptido de fusión del vih-1. a partir del ensayo de liberación de contenidos vesiculares se seleccionaron 5 péptidos que reducían la liberación causada por el vih-1 fp, los cuales han sido los analizados en los posteriores ensayos. estos péptidos correspondían a los nombrados como p7, p8, p10, p18 y p22, con las siguientes secuencias de aminoácidos: p7 apedigfcleggclvalg, p8 digfcleggclvalgcti, p10 eggclvalgctictdqcw, p18 lavrpgksaaqlvgelgs y p22 vgelgslygplsvsayva. con estos péptidos, se han realizado estudios de interacción y de unión péptido-modelos de membrana. Como modelos de membrana se han utilizado liposomas. Los estudios que se realizaron incluyeron estudios calorimétricos, ensayos de unión a liposomas mediante diferentes técnicas: técnica de centrifugación y equilibrio mediante diálisis, y observación de la interacción de los péptidos con liposomas (vesículas unilaminares gigantes) mediante microscopia confocal. en los ensayos de unión entre los péptidos y liposomas se observó que los péptidos de la proteína e1 disminuían la unión del péptido de fusión del vih a los liposomas, confirmando los resultados obtenidos en los ensayos de liberación de contenidos vesiculares. Se estudió la interacción de estos péptidos con el péptido de fusión del vih en disolución mediante calorimetría de titulación isotérmica (itc). mediante microscopía confocal se pudo observar como el péptido de fusión del vih-1 era capaz de romper los liposomas y de provocar la fusión de membranas, mientras que cuando se encontraba en presencia de los péptidos del gbv-c/hgv esto no sucedía. también se realizaron estudios de actividad superficial mediante la técnica de langmuir-blodgett, y se calcularon las concentraciones superficial en exceso y la de saturación, información que servirá para conocer la capacidad de los péptidos para formar monocapas estables en la interfase aire/agua. seguidamente se realizaron estudios de citotoxicidad, ensayos de hemólisis, estudio de la estructura mediante dicroísmo circular, ensayos de agregación de liposomas inducida por los péptidos y ensayos de transferencia de energía por resonancia. los diferentes ensayos muestran una interacción de los péptidos de la proteína e1 con el péptido de fusión del vih-1, dando lugar a una inhibición de la actividad que el péptido de fusión del vih-1 tiene sobre las membranas lipídicas. Las conclusiones finales obtenidas son: el primer péptido podría corresponderse con un posible péptido de fusión del gbv-c/hgv pero no muestra capacidad de inhibición de la actividad del péptido de fusión del vih-1. P10 queda descartado como posible inhibidor de la actividad del pf del vih-1 y podría tratarse de un péptido de fusión del gbv-c/hgv. P8, p18 y p22 muestran un comportamiento ambivalente. Los resultados negativos en algunos experimentos harían descartarlos para estudios posteriores. Pero en otros ensayos realizados en presencia del pf hace que se puedan considerar para futuros estudios. P7, que se corresponde con la región e1(19-36), parece estar claramente involucrado en la inhibición de la actividad del pf en modelos de membrana. Este péptido podría ser un candidato potencial para ser utilizado en futuras terapias anti-vih, aunque son necesarios más estudios por tal de elucidar el mecanismo exacto de la interacción p7-pf.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudios biofísicos de péptidos sintéticos de la proteína de envoltura e1 del gbv-c/hgv y su relación con el vih«
- Título de la tesis: Estudios biofísicos de péptidos sintéticos de la proteína de envoltura e1 del gbv-c/hgv y su relación con el vih
- Autor: Ma. Jesús Sánchez Martín
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 04/07/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María Asuncion Alsina Esteller
- Tribunal
- Presidente del tribunal: joan Estelrich latras
- nuria Vila romeu (vocal)
- (vocal)
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