Tesis doctoral de Marta Guerra Rebollo
El laboratorio de t. Thomson ha desarrollado de novo pequeños compuestos capaces de interferir en la interacción entre ubc13 y uev1, inhibiendo su actividad enzimática in vitro e in vivo. En células de mamífero, estos compuestos inhiben la poliubiquitilación a través de la lys63 de pcna así como la activación de nf-b por tnf. Estos son los primeros compuestos farmacológicos conocidos capaces de inhibir poliubiquitilación no-canónica, y hemos demostrado que presentan una actividad selectiva y efectos biológicos significativos, con potencialidad terapéutica. El más activo de estos compuestos ha sido denominado varubin. Para comprobar el efecto de varubin sobre la reparación translesional de dna tras daños genotóxicos, se realizaron ensayos de ubiquitinación (a través de la lys 63 de la ubiquitina) in vivo de pcna en ausencia y presencia de varubin y se analizaron los posibles efectos funcionales de esta inhibición. Con tal de estudiar el efecto de varubin en la ruta de reparación de rotura de doble cadena del adn, se pretrataron células hela y u2os con diferentes concentraciones de varubin y se realizó daño en el dna mediante irradiación gamma, las células se fijaron en varios tiempos tras la irradiación y se realizaron inmunocitoquímicas con anticuerpos contra varias proteinas implicadas en esta ruta (p-h2ax, 53bp1, rap80, etc). Para evaluar la capacidad de crecimiento tumoral in vivo se implantaron células pc-3/luc (que integran y expresan constitutivamente el gen de luciferasa) en próstatas de ratones nu/nu, y se seguirá su crecimiento y capacidad invasiva en tiempo real con cámaras ccd. Para determinar el posible efecto de varubin en el proceso de neoangiogénesis asociada a tumores se realizaron ensayos de angiogénesis in vitro utilizando el ensayo de formación de túbulos por células huvec cultivadas sobre matrigel (gfp) suplementado con vegf, con o sin varubin. Con tal de evaluar la capacidad invasiva in vitro de células tumorales humanas se hicieron ensayos de invasión in vitro en cámaras de boyden (transwell) recubiertas de matrigel. Varubin inhibe la actividad enzimática del heterodímero ubc13-uev in vitro e in vivo, inhibiendo de una manera dosis dependiente la activación de nf-¿b por tnf-¿ y la la poliubiquitilación de pcna vía lys63. Varubin sensibiliza a células tumorales epiteliales a los efectos antiproliferativos de compuestos como la doxorrubicina o el etopósido. Por el contrario, tiene poca actividad sensibilizante, o es protectora, de células de origen hematopoyético a los efectos citotóxicos de agentes genotóxicos. Varubin muestra actividad antitumoral en un modelo murino de xenoinjerto tumoral de cáncer de próstata. en otra línia de investigación y mediante un estudio enfocado a buscar ubiquitina ligasas que interaccionaran con ubc13-uev se encontró la proteina rnf8. Rnf8 posee 2 dominios functionales: un dominio fha y un dominio ring finger. Mediante su dominio ring finger, rnf8 recluta enzimas de conjugación de ubiquitinas. Recientemente, se ha demostrado que rnf8 es crucial en la formación de foci de reparación del dna en respuesta a daños genotóxicos. Asimismo, se le supone, aunque aún no se ha demostrado claramente, un papel en la activación del checkpoint de ciclo celular en respuesta a dichos daños. Para desarrollar este objetivo se utilizaron líneas celulares hela con integración estable de plásmidos de expresión inducible de rnf8 por tetraciclina (tet-on) con un tag de hemaglutinina (ha). Y líneas establemente deplecionadas para rnf8 (infección de lentivirus para la expresión de shrna) en células hela, pc3m, mcf7 y du145. Para estudiar las funciones de rnf8 en ciclo celular y en la activación de checkpoints, se utilizaron tanto las línas de sobreexpresión como las de infraexpresión y se realizaron experimentos de bloqueo y liberación en diferentes fases del ciclo celular (g1 utilizando el doble bloqueo con timidina, o en g2/m utilizando el bloqueo con nocodazol) que se analizaron mediante citometria de flujo. También se realizaron experimentos de inmunocitoquímica con diversos macadores de fases del ciclo (ciclinas a, b, etc) o tubulina con tal de determinar si hay una acumulación en alguna fase determinada del ciclo en ausencia o sobreexpresión de rnf8. La sobreexpresión de rnf8 causa la acumulación de células en mitosis provocando anomalías en la función del huso mitótico para tensar, alinear y segregar cromosomas. La depleción de rnf8 produce aumento de células en g1 y una disminución de las células en s además de un retraso en la salida del bloqueo con nocodazol, asociado a una menor degradación de la ciclina b1. a partir de resultados previos de un ensayo de yeast two hybrid se confirmó la interacción de rnf8 con varios de los candidatos mediante experimentos de coinmunoprecipitación y western blotting, inmunocitoquímica para observar colocalizaciones y se realizaron mutantes tanto en rnf8 como en los candidatos para determinar los dominios responsables de la interacción. Partiendo de la observación previa en la que rnf8 se localiza en nucleolo y en foci nucleares en ausencia de daño genotóxico, y que estos foci no corresponden a sitios de rotura espontánea del dna, se realizaron experimentos de inmunocitoquímica para intentar encontrar otras proteínas que también se localizan en estos foci. Rnf8 interacciona con rpsa a través del dominio fha. La treonina 223 de rpsa aunque relevante para la interacción, no descarta la implicación de otros residuos. Rnf8 y brca se localizan en nucleolo en ausencia de daño en el adn y se trasladan a los foci tras la inducción de un daño. Rpsa ancla a rnf8 en nucleolo mientras que brca requiere la presencia de rnf8 y de rpsa para localizarse en nucleolo. Rpsa se ubiquitina preferentemente por lys63 y su vida media no se ve alterada por los niveles de rnf8. Ensayos de ubiquitilación más sensibles indican que rnf8 puede estar implicado en esta modificación aunque quizá no directamente. La depleción de rpsa, rnf8, ubc13 o brca disminuye la síntesis proteica total, mientras que la sobreexpresión de rnf8 hace que los niveles de síntesis proteica en células irradiadas se equiparen a los de células sin tratar, sugiriendo que, al menos en parte, la disminución de la síntesis proteica provocada por radiación ¿ podría estar mediada por la función de rnf8.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudios funcionales de un nuevo inhibidor del enzima de conjugación de ubiquitinas ubc13 y de la ubiqÁ¼itina ligasa rnf8, con énfasis en su papel en la respuesta al daño al dna«
- Título de la tesis: Estudios funcionales de un nuevo inhibidor del enzima de conjugación de ubiquitinas ubc13 y de la ubiqÁ¼itina ligasa rnf8, con énfasis en su papel en la respuesta al daño al dna
- Autor: Marta Guerra Rebollo
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 28/09/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Timothy Thomson Okatsu
- Tribunal
- Presidente del tribunal: andrés Aguilera lópez
- bernat Crosas navarro (vocal)
- (vocal)
- (vocal)