Tesis doctoral de Herena Eixarch Ahufinger
La terapia génica nació a principios de los años 90 como una estrategia para la sustitución de genes defectuosos en determinadas células o tejidos en el ámbito de las enfermedades hereditarias, aunque desde entonces se han desarrollado múltiples estrategias para tratar enfermedades adquiridas, que incluyen diferentes tipos de cáncer o enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple (ms). La ms es una enfermedad crónica, inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (snc), mediada por células t cd4+, cuyos daños se traducen clínicamente en parálisis y discapacidad. La encefalomielitis autoinmune experimental (eae) es el modelo animal de la ms, con la que comparte múltiples características clínicas e histopatológicas. la creación de quimerismos moleculares mediante la expresión de transgenes en el sistema hematopoyético se ha asociado a la tolerización por parte del sistema inmune frente a estos transgenes. En este trabajo proponemos expresar un antígeno candidato de la ms (el péptido 40-55 de la glicoproteína mielínica de los oligodendrocitos) en el sistema hematopoyético murino con la finalidad de inducir tolerancia frente a éste. Utilizando procedimientos lo más cercanos posible a la clínica humana, hemos comprobado que la creación de quimerismo molecular utilizando el autoantígeno previene muy eficazmente la enfermedad, mientras que en animales con eae establecida, el trasplante de células hematopoyéticas expresando el autoantígeno mejora significativamente la enfermedad, si bien no se llega a crear quimerismo molecular, lo que permite obviar por completo el uso de tratamientos mieloablativos y hace más factible la aplicabilidad clínica de este tipo de estrategia terapéutica. además, a raíz de estos experimentos hemos descubierto que el nivel de expresión de un transgén potencialmente inmunogénico (egfp) en el contexto del trasplante hematopoyético en ratones sometidos a mieloablación parcial puede ser determinante en que se induzca tolerancia o se rechacen las células transducidas. objetivos 1- establecer un régimen de acondicionamiento que no afecte al curso clínico de la eae. 2- determinar si la expresión de mog40-55 en el sistema hematopoyético protege a los animales de desarrollar la eae de forma preventiva utilizando una estrategia de trasplante hematopoyético parcialmente mieloablativo. · determinar si niveles bajos de quimerismo molecular son suficientes para inducir tolerancia inmunológica. 3- determinar si esta misma estrategia, pero aplicada a animales con eae establecida, produce una remisión o mejoría de la enfermedad. 4- determinar si el nivel de expresión de la egfp en células hematopoyéticas transducidas y trasplantadas en ratones sometidos a mieloablación parcial es determinante en la inducción de una respuesta inmune o de tolerancia frente al producto de dicho transgén. metodología la eae se induce inmunizando cepas de rata y ratón susceptibles con péptidos o proteínas presentes en la vaina de mielina. En este proyecto se indujo la eae en ratones de la cepa sjl con el péptido 139-155 de la proteína proteolipídica (plp) y en la cepa c57bl/6j inmunizados con el péptido 40-55 de la glicoproteína mielínica de los oligodendrocitos (mog40-55). En primer lugar se evaluó el efecto de distintos regímenes de acondicionamiento (4 gy de irradiación corporal total (ict), 2 x 20 mg/kg de busulfán y 1000 mg/kg de treosulfán) en el curso clínico de la eae. Una vez establecido el régimen adecuado para realizar los estudios de tolerancia, se diseñó un vector retroviral que contenía una construcción con la secuencia codificante para el péptido mog40-55 sustituyendo a la región clip de la cadena invariante murina (li), que denominamos limog, junto a la secuencia codificante de la egfp como marcador. Se generaron líneas celulares estables productoras del vector retroviral para la transducción de las células murinas hematopoyéticas. Como control se utilizó un vector que contiene la secuencia codificante para la li murina y la egfp y un segundo vector control que únicamente codificaba para la egfp. Se acondicionó a los ratones receptores con busulfán, y posteriormente fueron trasplantados con aproximadamente 106 células de médula ósea (mo) transducidas. A los animales inmunizados antes o después del trasplante, se les valoró diariamente el curso clínico de la eae y al final del experimento se sacrificaron para realizar estudios de injerto y quimerismo molecular, inmunológicos e histopatología. para estudiar la influencia del nivel de expresión de transgenes sobre la inducción tolerancia inmunológica, se acondicionaron a los receptores con busulfán o con ict. Posteriormente se trasplantaron con células de mo transducidas con un vector que induce la expresión de niveles elevados de egfp y un segundo vector que induce la expresión de niveles más moderados de egfp. Se estudió el nivel de injerto y quimerismo, así como la presencia de anticuerpos específicos para egfp. resultados el treosulfán (1000 mg/kg) administrado antes de inducir la eae empeoró significativamente el curso clínico de ésta. Y lo mismo ocurrió con la ict (4 gy) tanto si se administraba antes como después de la inducción de la eae. Contrariamente, el acondicionamiento con busulfán (2 x 20 mg/kg) no alteró el curso clínico de la enfermedad, por ello se usó como régimen de acondicionamiento en el resto de experimentos. en el brazo preventivo, a los 21 días post-trasplante los ratones fueron inmunizados con el péptido encefalitogénico mog40-55. Observamos que un número elevado de los ratones trasplantados con la mo transducida con limog (8/13), estaban completamente protegidos frente a la eae, mientras que en los grupos control la mayoría desarrolló la enfermedad [control de enfermedad (14/15) y egfp (11/13); p<0,01]. Además, los pocos animales que enfermaban sufrían una eae menos severa en cuanto a la máxima puntuación clínica alcanzada [mog40-55: 0,9±1,5; egfp (control de transplante): 3,5±1,7; eae (control de enfermedad): 3,7±1,0; p<0,001] y a la puntuación clínica acumulada [mog40-55: 8,2±18,7; egfp: 58,4±29,2; eae: 63,0±27,5; p<0,001], lo que indicaba una protección parcial. respecto al brazo terapéutico, se han obtenido resultados valorables de tres experimentos independientes. Se trasplantó mo transducida cuando la enfermedad estaba establecida en la mayoría de los ratones. Los ratones trasplantados con el vector que expresaba el transgén limog quedaban tolerizados, remitiendo total o parcialmente los signos clínicos de la enfermedad (limog: 72,7%), mientras que el porcentaje de ratones que remitió los signos clínicos en ambos grupos control fue inferior [li (control de trasplante): 30,4%; eae (control de enfermedad): 5,3%; p<0,001). En los cultivos de esplenocitos de los ratones del grupo limog se hallaron niveles más elevados de il-10 e il-5, dos citoquinas que, entre otras, son secretadas por células t reguladoras de tipo 1 (tr1), lo que sugiere una posible implicación de éstas en la inducción de tolerancia conseguida en este modelo. observamos que los ratones del grupo limog rechazaban específicamente las células transducidas, lo que implicaba que la tolerancia se estaba induciendo en ausencia de quimerismo molecular. Por esta razón nos planteamos realizar esta misma aproximación terapéutica en animales no sometidos a acondicionamiento alguno. Se consiguió mejorar los signos clínicos de los ratones, siendo la puntuación clínica acumulada significativamente más baja en los ratones del grupo limog (limog: 26,9 ± 21 versus li: 47,6 ± 6,8; p<0,05). Estos hallazgos indican que el injerto de las células transducidas no es necesario para obtener un efecto tolerogénico clínicamente beneficioso. respecto al estudio del potencial inmunogénico de la egfp, se halló que la mayoría de ratones acondicionados con busulfán y trasplantados con células de mo que expresaban niveles altos de egfp, a pesar de tener injerto del donante, rechazaron específicamente las células transducidas (23/36), en contraposición a sólo 7 de los 36 ratones que recibieron células de mo con expresión moderada de egfp. Se evaluó la concentración de anticuerpos anti-egfp y no se observaron diferencias entre los diferentes grupos, lo que sugiere que la inmunidad humoral no juega un papel importante en estas respuestas inmunitarias. conclusiones 1- la creación de quimerismo molecular con péptido encefalitogénico mog40-55 en el sistema hematopoyético murino previene la eae. 2- en la aproximación preventiva, el nivel de quimerismo molecular no está relacionado con la inducción de tolerancia. Los ratones que quedaron protegidos de la eae presentaban niveles de quimerismo molecular similares a los de los ratones protegidos frente a la enfermedad. 3- el trasplante de células de mo expresando el péptido mog40-55 cuando la enfermedad estaba establecida (aproximación terapéutica) consiguió mejorar los signos clínicos y la histopatología de la eae, resultando en una remisión de la enfermedad en una fracción significativa de los animales. 4- en la aproximación terapéutica, las células transducidas fueron rechazadas específicamente en los ratones del grupo limog. A pesar de ello, se observó un claro beneficio clínico. 5- la inducción de tolerancia en ausencia de quimerismo molecular y la precoz mejoría de los signos clínicos tras el trasplante de las células transducidas sugiere que la tolerancia inducida en este modelo de eae es periférica y no central. La elevada expresión de il-5 e il-10 sugiere que, en este modelo, la tolerancia está mediada por células t reguladoras. 6- la terapia en ausencia de acondicionamiento es igualmente efectiva, haciendo que el procedimiento terapéutico sea mucho más exportable a la clínica humana. 7- el nivel de expresión del transgén en las células trasplantadas constituye un factor determinante en la inducción de tolerancia o de respuestas inmunitarias frente a las células transducidas. Este hecho es relevante para el diseño de vectores y protocolos de terapia génica.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudios sobre la inducción de tolerancia inmunológica mediante la expresión de antígenos en células hematopoyéticas murinas. aplicación en un modelo experimental de enfermedad autoinmune«
- Título de la tesis: Estudios sobre la inducción de tolerancia inmunológica mediante la expresión de antígenos en células hematopoyéticas murinas. aplicación en un modelo experimental de enfermedad autoinmune
- Autor: Herena Eixarch Ahufinger
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 18/12/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Jordi Barquinero Mañez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Juan Antonio Bueren roncero
- mar Tintore subirana (vocal)
- eva Martínez cáceres (vocal)
- joan Verdaguer autonell (vocal)