Tesis doctoral de Ezequiel Mas Del Molino
Resumen de la tesis: introducción: el atp es una molécula ampliamente conocida por su papel en muchas funciones fisiológicas intracelulares. Pero el atp puede actuar como molécula señalizadora a través de los receptores purinérgicos p2, los p2x, que son ionotrópicos, y los p2y que son metabotrópicos. Los p2x son canales iónicos que se abren cuando se les une el atp. Los p2y son receptores acoplados a proteínas g. Ambos tipos de receptores se han relacionado con diferentes patologías. Los metbolitos del atp, fruto de su hidrólisis por las ntpdasas (adp, amp y adenosina) también pueden activar otros receptores purinérgicos denominados p1 o receptores de adenosina que están acoplados a proteínas g (figura 1). figura 1 | esquema de la señalización purinérgica. Podemos observar como el atp directamente puede activar los receptores p2, sin embargo, metabólitos del atp (adp, amp y adenosina) también activan otro tipo de receptores p1. la liberación celular de atp es por exocitosis o por transportadores de atp. Investigaciones recientes indican que algunos hemicanales formados por conexinas (cx) podrían liberar atp mediante estímulo. las conexinas son proteínas de membrana formadas por cuatro dominios transmembrana y con los extremos amino y carboxi terminal citoplasmáticos. Las 21 conexinas descritas en el hombre difieren entre ellas por pocos aminoácidos. Las conexinas forman hexámeros llamados conexones. Dos conexones de dos células adyacentes forman una unión tipo comunicante o gap junction. Cuando un conexón se encuentra en una membrana que no está en contacto con otra célula forma un canal llamado hemicanal (figura 2). figura 2 | a; dibujo esquemático de las gap junctions. Cada célula contribuye con un conexón para formar una una gap junction. B; modelo topológico de una conexina. Hay 4 dominios transmembrana (m1-m4), dos asas extracelulares y una de intracelular. Los extremos amino y carboxi terminales son intracelulares (sí¶hl & willecke, 2004). se sabe que los hemicanales pueden abrirse en condiciones fisiológicas y en condiciones patológicas. También se ha podido estudiar que son permeables a iones y a metobolitos. Los canales formados por conexinas tienen una sensibilidad compleja. La mayoría de ellos tienen una conductancia sensible al potencial eléctrico. hcx32: la enfermedad hereditaria de charcot-marie-tooth (cmt) agrupa a varias formas de neuropatías periféricas hereditarias, afectando la función motora y la sensorial, y tienenuna elevada preValencia en la población. La forma de esta enfermedad ligada al cromosoma x (cmtx) se debe a las mutaciones en el gen que codifica la conexina 32 (cx32 o hcx32). Se conoces más de 290 mutaciones en este gen. la cx32 está localizada en las hendiduras de schmidt-lanterman y en las zonas paranodales de las células de schwann (cs), pero no se sabe qué papel fisiológico están jugando. Uno de los hipotéticos roles sería crear un atajo para comunicar de manera rápida la zona perinuclear y la zona periaxonal de la cs. Nuestra hipótesis es que las css se mantienen diferenciadas gracias a un mecanismo purinérgico autocrino, dado que expresan en su superficie distintos tipos de receptores p2x y p2y. En consecuencia, el papel de la cx32, seria facilitar la liberación de atp. Las mutaciones en la cx32 desequilibrarían la liberación de atp. Bien sea por un aumento o una disminución en el atp liberado, por lo que la cs entraría en apoptosis, produciéndose una lesión en la fibra nerviosa (figura 3). figura 3 | representación esquemática de una célula de schwann en tres diferentes situaciones. A; en una célula de schwann expresando la cx32 wt el atp es liberado a través de estas para una correcta función de la célula. B y c; una célula de schwann expresando una mutación de la cx32. En b la mutación incrementa la cantidad de atp liberado hiperactivando los receptores p2. En c la mutación de la cx32. En este caso la mutación disminuye la cantidad de atp liberado hipoactivando de los receptores p2. En los casos b y c esa desregulación llevaría a la desdiferenciación de la célula de schwann y la consecuente desmielinización. hcx26 y hcx30: por otra parte, la sordera es aquel conjunto de problemas relacionados con una audiometría por debajo del umbral considerado normal. La sordera sensorineural, no sindrómica y prelingual afecta a conexinas. la cóclea o caracol es el órgano que se encarga de convertir las vibraciones mecánicas en impulsos nerviosos. El órgano de corti, situado en la cóclea, contiene, entre muchos otros tipos celulares, las células pilosas sensoriales internas y externas. en este estudio nos hemos focalizado en las conexinas 26 y 30. Mutaciones en cualquier de estas dos proteínas pueden causar sordera de una manera recesiva o dominante dependiendo de la mutación. hasta el día de hoy se sabe que estas dos conexinas están formando una red que comunica, mediante las gap junctions a todas las células epiteliales y conectivas de la cóclea. Además, también se ha demostrado que estas conexinas forman hemicanales, en células epiteliales, que desembocan en espacios bañados tanto por la perilinfa como por la endolimfa (figura 4). Nuestro objetivo es caracterizar las propiedades iónicas y la permeabilidad para el atp de los hemicanales formados por hcx26, los formados por hcx30 y los formados por diferentes mutaciones de la hcx26 y de la hcx30. figura 4 | esquemas del órgano de corti y diferentes partes que lo forman y lo rodean. A: observamos diferentes partes del órgano de corti. En verde están resaltadas esas células endoteliales que contienen conexinas y en marrón aquellas células del tejido conectivo que también las expresan. B: mapa purinérgico de la cóclea. Observamos como los hemicanales liberarían atp a los espacios tanto bañados por perilinfa como por endolinfa (hildebrand et al. 2008; zhao et al. 2005). resultados: hcx32: mediante imágenes de luminiscencia hemos podido concretar que la liberación de atp se localiza en las zonas paranodales de los nódulos de ranvier donde se localiza la cx32 en los nervios periféricos. En los cultivos de css la liberación de atp también coincide con la localización de la cx32. utilizando ovocitos de xenopus que expressan la hcx32 y con la técnica de tevc y luminiscencia, hemos verificado que esta conexina se activa mediante voltaje generando una corriente de salida y una corriente de entrada que se inactiva progresivamente. Durante esta inactivación observamos una salida de atp (figura 5). figura 5 | representación gráfica de la corriente y el atp liberado por los hemicanales de hcx32, expresada en ovocitos, cuando son despolarizados. En la parte de arriba vemos la luz emitida cuando el voltaje vuelve a su estado inicial. En el medio observamos la corriente, donde destaca la corriente generada cuando el voltaje ya está de nuevo a -40 mv. La parte de abajo es una representación del pulso cuadrado que se utiliza como estímulo. los estudios de 5 mutaciones de esta hcx32 (s26l, p87a, ¿111-116, d178y y r220x) demostraron anomalías en las corrientes generadas y en la permeabilidad por el atp. hcx26 y hcx30: utilizando la misma técnica que arriba, hemos demostrado que la hcx26 no es permeable al atp cuando es activada mediante voltaje. sin embargo la hcx30 sí lo es, pero presenta, en la mayoría de casos, no presenta la inactivación de los corrientes de entrada (figura 6). Conforme a la literatura donde se demuestra que las conexinas 26 y 30 forman hemicanales heteroméricos, de forma que hemos expresado ambas conexinas conjuntamente en un solo ovocito. Los resultados indican que la hcx26 tiene un papel regulador en estos hemicanales. La hcx26 disminuye el número de hemicanales que no son capaces de inactivar sus corrientes de entrada. Además, estabilizan la cantidad de atp que es liberado a través de estos canales en condiciones normales y bajas en ca2+, e incrementa la relación atp/corriente-entrada de estos hemicanales. en cuanto a las mutaciones de la conexina hcx26 encontramos que, a excepción de la mutación n54s, todas ellas son parcialmente permeables al atp, y todas ellas presentan alguna anomalía en los corrientes de salida y/o de entrada. Por otro lado, la mutación t5m de la hcx30, presenta corrientes más pequeñas que la forma normal y, además, no modifica la falta de inactivación de las corrientes de entrada. figura 5 | representación gráfica de la corriente y el atp liberado por los hemicanales de hcx30 cuando son despolarizados. En la parte de arriba vemos la luz emitida gracias a la reacción de la luciferina-luciferasa. Es cuando el voltaje vuelve a los -80 mv iniciales que encontramos las corrientes de entrada que no son capaces de inactivarse conllevando una salida incontrolada de iones entre ellos el atp. los hemicanales heteroméricos formados por mutaciones de la hcx26 y la hcx30 no presentan la corrección en la relación atp/corriente-entrada que sí presentan cuando contienen la hcx26. Además, tampoco corrigen el número de hemicanales que no inactivan las corrientes de entrada. conclusiones: 1. Hemos demostrado que los hemicanales de hcx32 liberan atp bajo diferentes estímulos. 2. Hemos demostrado que los hemicanales mutados de hcx32 presentan anomalías en esta liberación de atp. 3. Hemos demostrado que los hemicanales de hcx26 no liberan atp cuando los estimulamos eléctricamente. 4. Hemos demostrado que los hemicanales de mutaciones de hcx26 generan corrientes diferentes y, excepto la n54s, liberan atp. 5. Hemos demostrado que los hemicanales de hcx30 liberan atp y presentan problemas de inactivación. 6. Hemos demostrado que los hemicanales de hcx26 regulan la liberación de atp pero no las corrientes en hemicanales formados por hcx26 y hcx30. 7. Hemos demostrado que las mutaciones de hcx26 no ejercen esta regulación en la hcx30. objetivos logrados con en el programa de formación: durante los 4 años de formación me he formado como investigador aprendiendo como se trabaja en un laboratorio tanto nacional como internacional. He aprendido como abordar una incógnita científica utilizando la literatura y el razonamiento. Todo esto gracias al aprendizaje de diferentes técnicas: 1. Western blot y immunofluorescencia 2. Frap (fluorescence recovery after photobleaching) and sldt (scrap loading dye transfer) 3. Dye loading 4. Tevc (two electrode voltage clamp) 5. Lecturas, imágenes y vídeos de luminiscencia. Tratamiento y análisis de imágenes. 6. Cirugía en animales para investigación 7. Cultivos primarios y de líneas celulares eucariotas y cultivos bacterianos 8. Manipulación y obtención de material genético 9. Captación de oscilaciones y olas de calcio bibliografía: ¿ bahima l, aleu j, elias m, martín-satué m, muhaisen a, blasi j, marsal j, solsona c. Endogenous hemichannels play a role in the release of atp from xenopus oocytes. J cell physiol. (2006); 206(1):95-102. ¿ colomar a, amédée t. Atp stimulation of p2x(7) receptors activates three different ionic conductances on cultured mouse schwann cells. Eur j neurosci. (2001); 14(6):927-36. ¿ jeng lj, balice-gordon rj, messing a, fischbeck kh, scherer ss. The effects of a dominant connexin32 mutant in myelinating schwann cells. Mol cell neurosci. (2006); 32(3):283-98. ¿ zhao hb, yu n, fleming cr. Gap junctional hemichannel-mediated atp release and hearing controls in the inner ear. Proc natl acad sci u s a. (2005); 102(51):18724-9.
Datos académicos de la tesis doctoral «Is the extracellular atp a key in x-linked charcot-marie-tooth disease and in inherited non-syndromic deafness?«
- Título de la tesis: Is the extracellular atp a key in x-linked charcot-marie-tooth disease and in inherited non-syndromic deafness?
- Autor: Ezequiel Mas Del Molino
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 25/02/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Carles Solsona Sancho
- Tribunal
- Presidente del tribunal: raul Estevez povedano
- luc Leybaert (vocal)
- (vocal)
- (vocal)