Tesis doctoral de Ursula Flores Perez
La tesis doctoral está redactada como un «compendio de publicaciones» en los idiomas español e inglés con cinco capítulos de resultados que detallan un trabajo independiente de los cuales los tres primeros trabajos han sido publicados en revistas de prestigio y los dos últimos se hallan en preparación para su posterior publicación. Además dos apéndices, uno refiere a un capítulo de un libro (carotenoids) que está en prensa (blackwell publishing, 2008. Isbn 13: 978-1405131513) y el otro a los «métodos detallados» empleados en este trabajo. isoprenoides plastídicos como los carotenoides, las clorofilas, o las hormonas giberelinas y ácido abscísico son esenciales para el crecimiento y desarrollo de las plantas. El objetivo principal de este trabajo doctoral es el estudio de los mecanismos reguladores de la biosíntesis de isoprenoides en plastos, particularmente a partir de la ruta del 4-metileritritol fosfato (mep). Para ello se emplearon dos estrategias: (1) dirigida (análisis de la influencia de la enzima hds en el control del flujo metabólico de la ruta), y (2) no-dirigida (identificación y caracterización de mutantes resistentes a un bloqueo de la ruta con fosmidomicina). el primer objetivo de este trabajo fue la caracterización de la contribución de la enzima la enzima 1-hidroxi 2-metíl 2-butenil 4-difosfato (hmbpp) sintasa (hds) que cataliza la penúltima reacción de la ruta del mep. Con el objetivo de estudiar la contribución de la enzima hds al control del flujo metabólico de la ruta, se analizó el efecto de su sobre-expresión en la acumulación de productos finales de la ruta del mep (i.E., Carotenoides) tanto en e. Coli como en a. Thaliana. Para ello se generaron cepas de e. Coli en las que se sobreprodujo una proteína recombinante con actividad hds y líneas transgénicas de sobre-expresión de hds en plantas de arabidopsis thaliana. Los resultados obtenidos para bacterias y plantas fueron similares, sin encontrar efecto de la sobre-producción de la enzima hds en la producción de pigmentos, señalando que la enzima hds no tiene un papel limitante en la bisíntesis de los precursores isoprenoides (flores-pérez, et al. 2008 biochem biophys res commun). con el objetivo de identificar y caracterizar mecanismos moleculares que regulan la biosíntesis de los precursores comunes de estos isoprenoides a través de la ruta plastídica del metileritritol 4-fosfato (mep), se aislaron varias mutantes de arabidopsis thaliana capaces de resistir el bloqueo letal de la ruta por el inhibidor competitivo fosmidomicina (fsm). Entre ellas, las mutantes rif10 y rif1 (resistant to inhibition by fsm 1 y 10) y ia mutante ppi1 (plastidprotein import 1) se caracterizaban por un notable fenotipo pálido y un retraso en el desarrollo asociado a la resistencia a fsm, a pesar de que en los tres casos el fenotipo de resistencia a fsm estaba asociado a niveles aumentados post-transcripcionalmente de las enzimas dianas del inhibidor, dxs y dxr. La mutación en rif10 provoca la pérdida de actividad de una exoribonucleasa plastídica implicada en la síntesis de proteínas en plastos (sauret-gí¼eto et al. 2006 plant physiology), mientras que el gen mutado en el mutante ríf1, que había sido previamente descrito como codificante para una óxido nítrico sintasa mitocondrial, en realidad codifica para una gtpasa necesaria para el correcto ensamblaje de los ribosomas plastídicos (flores-pérez et al. 2008 plant cell). La pérdida de función de estos genes resulta en una producción alterada de proteínas codificadas por el genoma plastídico (plastoma), entre las que se encuentra clpp1, una subunidad catalítica del complejo de la proteasa clf mutantes de otras subunidades del complejo codificadas por el genoma nuclear también muestran niveles aumentados de dxs y dxr (flores-pére, et al. 2008 plant cell), lo que demuestra que la proteasa clp regula la degradación de estos enzimas y, por tanto, puede influir en el flujo de la ruta mep y en la producción de isoprenoides plastídicos. Apoyando este modelo, hemos comprobado que los mayores niveles de dxs y dxr presentes en la mutante ppi1 no resultan de una mayor tasa de importe de estas proteínas a plastos (ya que en realidad es menor en el mutante que en las planta silvestres) sino posiblemente de un importe defectuoso de subunidades catalíticas y reguladoras del complejo proteolítico clp. la última mutante en caracterizar fue la ríf18, que a diferencia de las mutantes pálidas presenta un fenotipo verde en presencia de los inhibidores déla ruta del mep: fsm, clomazona (clm), y también es resistente a la inhibición de la ruta del mevalonato por mevinolina (mev). La pérdida de función del gen codifica para rif18, se ha descrito como un regulador pleiotrópico de respuesta a azúcares (prl1). En las plantas mutantes rif18, la resistencia a los inhibidores de la ruta mep parecen responder a un flujo acelerado de la ruta por la posible mayor presencia de sustratos iniciales como consecuencia de la mayor sensibilidad a azúcares. El flujo acelerado de la ruta del mep no solo resulta en resistencia a inhibidores sino a un mayor importe de precursores isoprenoides desde el plasto hacia el citosol.
Datos académicos de la tesis doctoral «Mecanismos reguladores de la biosíntesis de isoprenoides en pastos de arabidopsis thaliana«
- Título de la tesis: Mecanismos reguladores de la biosíntesis de isoprenoides en pastos de arabidopsis thaliana
- Autor: Ursula Flores Perez
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 20/06/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Manuel Rodriguez Concepcion
- Tribunal
- Presidente del tribunal: albert Ferrer prats
- r. paul Jarvis (vocal)
- m. vincent Burlat (vocal)
- jordi García mas (vocal)