Tesis doctoral de Francisco Rausell Palamós
Objetivo: analizar el efecto del envejecimiento post-ovulatorio de ovocitos de ratón in vitro en presencia de diferentes concentraciones de ditiotreitol (dtt) sobre (1) fecundación y desarrollo embrionario hasta la fase de blastocisto; (2) niveles relativos de actividad glutatión s-transferasas (gsts) y tioles, incluyendo glutatión reducido (gsh), en ovocitos; (3) niveles de actividad del factor promotor de la metafase (mpf) y protein-kinasas activada por agentes mitogénicos (mapks) en ovocitos; (4) activación partenogenética de ovocitos; (5) asignación celular al linaje de la masa celular interna (icm) y trofectodermo (te) en blastocistos; y (6) fragmentación del adn en blastocistos. material y métodos: los ovocitos ovulados por hembras híbridas de ratón, de 7 a 9 semanas de edad, estimuladas con gonadotrofinas exógenas se envejecieron en presencia de 0, 5, 50 y 500 mm de dtt durante 6 ó 9 h antes de la inseminación in vitro, determinación de los niveles relativos de gsts y tioles, y actividad mpf y mapks, o estimulación partenogenética con etanol, timerosal+dtt o roscovitina. Los niveles relativos de actividad gsts y tioles en ovocitos se evaluaron mediante técnicas de microscopía confocal. Los niveles relativos de actividad mpf y mapks se determinaron mediante electroforesis de gel de poliacrilamida (sds-page). Los embriones resultantes de la fecundación in vitro se cultivaron hasta la fase de blastocisto. La asignación celular a la masa celular interna o al trofectodermo y fragmentación de adn en blastocistos se evaluó utilizando técnicas de epifluorescencia. resultados: el porcentaje de fecundación fue significativamente mayor en ovocitos incubados en presencia de 50 y 500 mm de dtt en comparación con los ovocitos expuestos a 0 y 5 mm de dtt. El envejecimiento de los ovocitos en presencia de 50 y 500 mm de dtt también tuvo efectos beneficiosos en el posterior desarrollo embrionario hasta la fase de blastocisto. El tratamiento de los ovocitos con 5, 50 y 500 mm de dtt contrarrestó la caída de los niveles de actividad gsts y tioles asociada con el envejecimiento post-ovulatorio de los ovocitos. Los ovocitos envejecidos durante 9 h en presencia de 500 mm de dtt mostraron una mayor actividad mpf que los ovocitos incubados durante el mismo período en 0 y 5 mm de dtt. Los niveles de actividad mapks fueron significativamente menores en el grupo de 5 mm de dtt en comparación con los ovocitos frescos incubados durante 1 h en ausencia de dtt y los ovocitos envejecidos durante 9 h en presencia de 50 mm de dtt. En el grupo de ovocitos controles, no tratados, y el grupo de ovocitos tratados con roscovitina no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de activación partenogenética entre ovocitos incubados durante 1 h en ausencia de dtt ó 9 h en presencia de 0, 5, 50 or 500 mm dtt. En los grupos de ovocitos expuestos a etanol ó timerosal+dtt, los ovocitos frescos mostraron un menor porcentaje de activación partenogenética que los ovocitos envejecidos in vitro en 0, 5, 50 y 500 mm de dtt. Los ovocitos envejecidos in vitro en presencia de 500 mm de dtt mostraron un porcentaje significativamente mayor de activación partenogenética que los ovocitos envejecidos en 0, 5 y 50 mm de dtt. El envejecimiento de los ovocitos en presencia de 50 y 500 mm de dtt aumentó significativamente el número total de células en blastocistos comparado con el grupo de 0 mm de dtt. El tratamiento de los ovocitos con 5, 50 y 500 mm de dtt disminuyó significantemente el cociente entre número de núcleos con fragmentación del adn y número de células de la icm cuando se comparó con el grupo de 0 mm de dtt. El número de células de la icm y el cociente icm/te en blastocistos fue significativamente mayor en los grupos de 50 y 500 mm de dtt que en el grupo de 0 mm de dtt. conclusiones: el envejecimiento post-ovulatorio de ovocitos de ratón in vitro en presencia de dtt se asocia con (1) mayores porcentajes de fecundación y desarrollo embrionario hasta el estadio de blastocisto; (2) mayores niveles relativos de actividad gsts y tioles, incluyendo gsh, en ovocitos; (3) mayores niveles de actividad mpf y mapks en ovocitos; (4) ausencia de efecto sobre el potencial de activación partenogenética tras exposición a etanol o roscovitina, o mayor susceptibilidad tras tratamiento con timerosal+dtt; (5) mayor número de células de la icm y cociente entre número de células de la icm y te en blastocistos; y (6) mayor porcentaje de núcleos con fragmentación del adn en la icm en blastocistos.
Datos académicos de la tesis doctoral «Efecto de un envejecimiento post-ovulatorio in vitro de ovocitos de ratón en presencia de ditiotreitol sobre ovocitos y embriones preimplantatorios«
- Título de la tesis: Efecto de un envejecimiento post-ovulatorio in vitro de ovocitos de ratón en presencia de ditiotreitol sobre ovocitos y embriones preimplantatorios
- Autor: Francisco Rausell Palamós
- Universidad: Universitat de valéncia (estudi general)
- Fecha de lectura de la tesis: 23/10/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Juan José Tarín Folgado
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Antonio Cano sánchez
- Manuel Aviles sanchez (vocal)
- Jorge Ten morro (vocal)
- Fernando García ximénez (vocal)