El inhibidor del proteasoma bortezomib induce parada de ciclo celular y adoptosis en células que expresan la oncoproteína bcr-abl.

Tesis doctoral de Mª Pilar Albero Belda

La leucemia mieloide crónica (lmc) es una enfermedad hematológica que resulta de la proliferación desregulada de una célula troncal hematopoyética pluripotencial. Esta enfermedad consta de dos fases: una fase crónica, caracterizada por una expansión masiva de precursores mieloides y de células maduras que abandonan la médula ósea prematuramente pero mantienen su capacidad de diferenciación normal y una fase aguda denominada crisis blástica, caracterizada por presentar más de un 30% de blastos indiferenciados en médula ósea y sangre periférica (melo et al. 2003, weisberg et al. 2006). la lmc fue el primer cáncer que se relacionó con una anormalidad genética debida a una traslocación cromosómica denominada cromosoma philadelphia y que se encuentra en el 95% de los pacientes con lmc (shtivelman et al. 1985, verfaillie. 1998). Este cromosoma resulta de la traslocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22, t(9,22)(q34;q11). Como resultado de esta translocación entre los brazos largos de cada cromosoma, el gen bcr (breakpoint-cluster region) del cromosoma 22 y el gen abl (abelson leukemia) del cromosoma 9 quedan fusionados en el cromosoma 22 (cromosoma ph), generando un oncogen que codifica una proteína quimérica denominada bcr-abl, con actividad tirosina kinasa constitutivamente activa (ben­ neriah el al. 1986). dependiendo de los distintos puntos de ruptura del gen bcr, esta translocación principalmente da lugar a tres tipos distintos de transcritos, resultando en proteínas de fusión responsables de distintos tipos de leucemia: p190, que se expresa en células de leucemia linfoblástica aguda; p210, que se expresa en células de leucemia mieloide crónica y p230, que se asocia con la leucemia granulocítica crónica. la lmc, al igual que el resto de los cánceres, se caracteriza tanto por un crecimiento descontrolado como por una inhibición de la apoptosis de las células que forman el tumor. Esto es debido a la pérdida del control del ciclo celular que se ejerce continuamente sobre una célula que se divide de forma normal. La pérdida de este control es la diana de acción final de los múltiples genes y cascadas de señalización que aparecen desregulados en las células tumorales. al contrario que abl, la proteína bcr-abl es una oncoproteína constitutivamente activa que se encuentra exclusivamente en el citoplasma de la célula, acomplejada con proteínas del citoesqueleto. Mientras que la proteína nativa abl migra constantemente entre el núcleo y el citoplasma y presenta una actividad tirosin-kinasa finamente regulada, la proteína bcr-abl es una oncoproteína activa que presenta una actividad tirosín kinasa aumentada y descontrolada. Esta actividad kinasa puede fosforilar diversos substratos, lo que resulta, asu vez, en una desregulación de numerosas vías de transducción de señales que participan en procesos tan básicos como son la proliferación y diferenciación celular (jiang et al. 2000, sawyers. 1993), migración, adhesión (gordon et al. 1987) y apoptosis (bedi et al. 1994) y su expresión juega un papel patogenético en la inducción de la lmc y lla. bcr-abl activa de forma directa la ruta de señalización mediada por pi3kiakt, implicando esta ruta en la regulación anormal del ciclo celular y la apoptosis que se observa en células bcr-abl positivas (savage et al. 2002). El sistema pi3kiakt induce señales de supervivencia a través de distintas rutas: activa la ruta ras/raf, previene la apoptosis mediante la fosforilación de bad y la regulación positiva de bcl-xl, inhibe la actividad de las caspasas, induce la transcripción de genes implicados en el ciclo celular mediante la activación de factores transcripcionales (por ejemplo de la familia de forkhead), así como mediante la activación del factor de transcripción nf-kb (gorre et al. 2001). Además, en nuestro grupo se ha caracterizado la implicación de esta ruta en un aumento de la degradación de proteínas en el proteasoma (andreu et al. 2005). Por otro lado, bcr-abl también está implicado en la ruta de señalización jakistat que es otra vía que también tiene un papel clave en la proliferación y transformación oncogénica (horita et al. 2000). La actividad tirosín kinasa de bcr-abl resulta en una inducción del ciclo celular mediada por la ruta de señalización p13k y que incide sobre los mecanismos de control de la fase g1. Esta inducción está asociada con la inactivación de p27kip1 y un aumento de la expresión y función de las ciclinas d y e. En nuestro grupo también se ha demostrado que bcr-abi/pi3k regula la expresión de p27kip1 a nivel de la transcripción, y también regula los niveles de p27kip 1 por aumento de su degradación por el proteasoma (andreu, et al. 2005). el descubrimiento de un fármaco que inhibe la actividad tirosina-kinasa de bcr­ abl, sti571 (mesylato de lmatinib, comercializado como gleevec® por novartis), ha sido de vital importancia para el tratamiento de pacientes con lmc. Además, resulta una herramienta muy útil para el estudio de esta enfermedad en el laboratorio. Este compuesto, fue descubierto a finales de los años 80 y se trata de una 2- fenilaminopirimidina que inhibe específicamente la actividad tirosina-kinasa de pdgf­ r (qiatelet-.Qerived growth [actor t:eceptor), e-kit y abl (buchdunger et al. 1996, druker et al. 2000). Este compuesto se une al dominio kinasa de abl, bloqueando la entrada de atp en esta región de la proteína (druker. 2008, schindler et al. 2000). Estudios preclínicos mostraron que el sti571 inhibía específicamente el crecimiento de células de leucemia, inducía la diferenciación en las líneas celulares bcr-abl positivas y hacía que estas células volvieran a ser dependientes de il-3 (interleukina-3) para su correcta proliferación (deininger et al. 1997). sin embargo, se han detectado resistencias al sti571 en pacientes con lmc y lla. Estas resistencias se deben a diferentes factores que pueden implicar fenómenos de amplificación génica de bcr-abl; de mutaciones a nivel del dominio de unión de atp de abl (bloom et al. 2003, nagar. 2007), o sobreexpresión de kinasas src (quintas-cardama et al. 2007), que participan en numerosas vías de señalización intracelular que regulan la invasión, la migración, el crecimiento y la supervivencia de las células tumorales. pero, hoy en día se sabe, que al menos el 50% de los pacientes que sufren recaídas tras el tratamiento con lmatinib presentan mutaciones puntuales en al menos 40 aminoácidos diferentes de bcr-abl distribuidos a lo largo del dominio kinasa de abl (druker, 2008). existen numerosas mutaciones en el dominio de unión al atp de c-abl que generan resistencias de mayor o menor grado al tratamiento con sti571, y ciertas mutaciones tienen lugar por cambios conformacionales sobre la kinasa, por un lado disminuyendo la flexibilidad del p-loop de manera que no llega a adoptarse el cambio conformacional necesario para la unión del sti571 en esta región; este es el caso de las mutaciones q252h, y253f, e255k etc. (Shah et al. 2002); y por otro lado afectando a la región de activación, a-loop. Esta región puede adoptar una conformación cerrada o inactiva y una abierta o activa. En el caso de las mutaciones, h396, e355, m351, etc., El sti571 fuerza la conformación cerrada o inactiva siendo incapaz de unirse a la configuración activa o abierta (druker. 2008, la rosee et al. 2002). Otro tipo de mutación es la debida a la sustitución de aminoácidos en el sitio de unión al sti571; éste es el caso de la mutación t3151, uunto con f317l, y f359v) (martinelli et al. 2005) siendo la de mayor preValencia uunto con la mutación e255k) (druker. 2008), así como también la de peor pronóstico (shah, et al. 2002, yamamoto et al. 2004). Debido a la aparición de estas mutaciones resistentes al tratamiento con sti571, se han buscado nuevas alternativas terapéuticas, tales como incremento de la dosis de sti571, combinaciones de sti571 con diferentes quimioterápicos y uso de inhibidores de otras kinasas tales como src-kinasa. además, se han desarrollado otros inhibidores de la actividad tirosina-kinasa de bcr-abl (martinelli, et al. 2005). Entre estos, cabe destacar nilotinib, de la familia de sti571 (amn107, tasigna). Es altamente selectivo y potente contra la actividad kinasa de abl, incluso es de 20 a 50 veces más potente que el lmatinib contra bcr-abl. Este fármaco es activo contra la mayoría de las mutaciones puntuales de bcr-abl excepto la mutación t3151. Otro inhibidor de la actividad tirosina-kinasa es el oasatinib, inhibidor de src/abl (bms-354825; sprycel). Ambos nilotinib y dasatinib inhiben la actividad de la mayoría de las mutaciones observadas en pacientes con resistencias al lmatinib, con la excepción de la mutación t3151, por ello han sido aprobados por la fda para el tratamiento de pacientes con resitencias o intolerancia al lmatinib (druker. 2008, kantarjian et al. 2007). en nuestro grupo se ha caracterizado la implicación bcr-abl en un aumento de la degradación de proteínas en el proteasoma (andreu et al. 2005). La vía ubicuitina­ proteasoma es la responsable de la degradación de la mayoría de las proteínas intracelulares. Este sistema de degradación proteosomal está implicado en la proteólisis de proteínas de corta vida funcional, así como de la regulación de la proliferación celular, diferenciación, supervivencia celular y apoptosis. Todas estas propiedades hizo que este sistema emergiera como una nueva posible diana del tratamiento del cáncer (ling et al. 2003). los inhibidores del proteasoma bloquean la degradación de proteínas causando acumulación de proteínas dañadas lo que provoca respuesta de choque térmico y muerte celular (chauhan et al. 2005). Son, por tanto, una nueva y potente clase de agentes anticancerígenos, puesto que regulan la progresión del ciclo celular impidiendo la proliferación e induciendo a entrada en apoptosis (gatto et al. 2003). Por ello, la especificidad de los inhibidores del proteasoma y el potencial para actuar como agentes anti-cancerígenos han sido objeto de estudio en los últimos años. existen distintos inhibidores del proteasoma, lactacistina, mg132, benzamide, aclacinomicina a, etc., Entre los que cabe destacar el bortezomib (ps-341 o velcade®) (adams. 2004). Este fármaco forma parte de una nueva generación de inhibidores reversibles del proteasoma desarrollados por millennium pharmaceuticals lnc. Este compuesto presenta una actividad potente frente al crecimiento de varias líneas celulares tumorales en estudios tanto ín-vílro como in-vivo. Recientemente, en mayo 2003, la fda (food and drug administration) ha aprobado el uso del bortezomib para el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple (ling, et al. 2003) y actualmente también se emplea además para el tratamiento del linfoma del manto (perez-galan et al. 2006). el bortezomib es un análogo del ácido dipeptidil borónico que inhibe selectivamente y de forma reversible la actividad quimiotripsina mediante una unión directa a la subunidad 5(vink el al. 2006) del núcleo catalítico 208 del proteasoma (boccadoro et al. 2005, sunwoo el al. 2001). Los efectos anticarcinógenos del bortezomib se han demostrado en modelos xenográficos de mieloma múltiple (hideshima et al. 2001) y en otro tipo de cánceres como son los de pulmón, de próstata, páncreas, colon y melanoma entre otros (boccadoro, et al. 2005, zhu el al. 2005). También se han realizado estudios en leucemias, obteniéndose resultados favorables del fármaco (gatto, et al. 2003; pahler et al. 2003; colado et al. 2008).

Datos académicos de la tesis doctoral «El inhibidor del proteasoma bortezomib induce parada de ciclo celular y adoptosis en células que expresan la oncoproteína bcr-abl.«

• Título de la tesis:  El inhibidor del proteasoma bortezomib induce parada de ciclo celular y adoptosis en células que expresan la oncoproteína bcr-abl.
• Autor:  Mª Pilar Albero Belda
• Universidad:  Cardenal herrera-ceu
• Fecha de lectura de la tesis:  17/07/2009

Dirección y tribunal

• Director de la tesis
  • Ignacio Pérez Roger
• Tribunal
  • Presidente del tribunal: javier León serrano
  • Miguel Campanero garcia (vocal)
  • carmen Ivorra ivorra (vocal)
  • dolors Colomer pujol (vocal)