Tesis doctoral de Severiano Dos Anjos Vilaboa
La isquemia cerebral es una de las principales causas de muerte y discapacidad en los países industrializados y ocasiona un gran costo socioeconómico a la sociedad. Uno de los factores importantes que afectan la muerte neuronal promovida tras el daño isquémico es la sobreactivación de receptores glutamatérgicos debida al aumento de glutamato en el espacio extracelular durante el proceso isquémico. Esta sobreexcitación da lugar a un gran incremento del calcio intracelular, que activa vías intracelulares que finalmente promueven la muerte neuronal. en esta memoria se describe la expresión de los receptores ionotrópicos de glutamato de nmda y ampa a través de distintos modelos experimentales, lo cual contribuye al conocimiento de los mecanismos implicados en el daño cerebral y la vulnerabilidad regional promovidos por isquemia/reperfusión (i/r) y ogd (privación de oxígeno y glucosa). Los ensayos i/r in vivo se llevaron a cabo usando un modelo de isquemia global transitoria en rata. El estudio de ogd se realizó en ensayos ex vivo usando secciones hipocampales. Para ello se ha cuantificado la expresión de las distintas subunidades que componen los receptores de nmda (nr1, nr2a y nr2b) y ampa (glur1 y glur2) en distintas estructuras cerebrales de cerebro de rata, a nivel de arnm y de proteína, a través de las técnicas de pcr en tiempo real y western blot respectivamente. Asimismo, se han cuantificado los niveles del marcador de microglia activada cd11b/cd18 (mac-1) mediante técnicas de pcr en tiempo real e inmunohistoquímica como medida de la respuesta inflamatoria observada tras i/r in vivo. los ensayos in vivo mostraron un descenso significativo en los niveles de arnm de las subunidades nr1, nr2a y nr2b del receptor de nmda, así como de las subunidades glur1 y glur2 del receptor de ampa en todas las estructuras cerebrales estudiadas (corteza cerebral, caudado-putamen y áreas hipocampales) después de 48 horas de reperfusión tras el proceso isquémico. Sin embargo, el nivel de descenso es distinto entre las diferentes áreas cerebrales estudiadas, mostrando principalmente niveles de arnm más altos la corteza cerebral que las áreas hipocampales. Se observaron también descensos significativos en los niveles de proteína a través de los ensayos de western blot. En contraposición a los resultados anteriores, se obtuvieron incrementos significativos en los niveles de arnm y proteína del marcador cd11b/cd18 en estas condiciones (dos-anjos et al., 2009a, b). los ensayos ex vivo para cuantificar niveles de arnm fueron caracterizados inicialmente analizando el efecto del tiempo, la temperatura de incubación y distintos medios de incubación sobre la expresión de genes de referencia (gapdh, mast2 y íY-actina). Esto permitió definir una ventana de trabajo de 6 horas tras el sacrificio del animal, en la cual los niveles de arnm se mantienen estables en una solución tamponada de sales de ringer a una temperatura de 25ºc. El resto de condiciones no dieron lugar a modelos estables (dos-anjos et al., 2008). Usando este modelo, las secciones hipocampales fueron sometidas durante 30 minutos a condiciones de ogd, lo cual dio lugar a un descenso significativo en los niveles de arnm de las subunidades nr1, nr2a y nr2b del receptor de nmda, así como del factor de transcripción c-fos. Después de 3 horas de reperfusión se observaron aumentos de los niveles de arnm, especialmente para el gen c-fos. Se obtuvieron resultados similares en ausencia de calcio extracelular, lo cual descarta que este ión sea el factor desencadenante de los cambios observados en los niveles de arnm tras la ogd. Los niveles de arnm de las subunidades del receptor de nmda no se modificaron en ensayos en presencia de glutamato, a concentraciones similares a las que se producen durante la ogd, lo que indica que el aumento de glutamato no es la única causa responsable de los descensos encontrados tras la ogd. La presencia de antagonistas de los receptores de nmda y de ampa/kainato en el medio de incubación originaron descensos similares en los niveles de arnm de las subunidades del receptor de nmda a los que ocurren durante la ogd, sin embargo no se observaron descensos adicionales durante la ogd (dos-anjos et al., 2009c, ). bibliografía dos-anjos s, martínez-villayandre b, montori s, salas a, pérez-garcía cc, fernández-lópez a. 2008. Quantitative gene expression analysis in a brain slice model: influence of temperature and incubation media. Anal biochem. 378(1):99-101. dos-anjos s, martínez-villayandre b, montori s, regueiro-purriños mm, gonzalo-orden jm, fernández-lópez a. 2009a. Transient global ischemia in rat brain promotes different nmda receptor regulation depending on the brain structure studied. Neurochem int. 54(3-4):180-5. dos-anjos s, martínez-villayandre b, montori s, regueiro-purriños mm, gonzalo-orden jm, fernández-lópez a. 2009b. Global ischemia-induced modifications in the expression of ampa receptors and inflammation in rat brain. Brain res. 1287:20-7. dos-anjos s, martínez-villayandre b, montori s, pérez-garcía cc, fernández-lópez a. 2009c. Early modifications in nmdar subunit mrna levels in an oxygen and glucose deprivation model using rat hippocampal brain slices. Neurosci. In press.
Datos académicos de la tesis doctoral «Expresión de los receptores glutamatérgicos de nmda y ampa tras la isquemia cerebral. efecto de la privación de oxígeno y glucosa sobre la expresión del receptor de nmda«
- Título de la tesis: Expresión de los receptores glutamatérgicos de nmda y ampa tras la isquemia cerebral. efecto de la privación de oxígeno y glucosa sobre la expresión del receptor de nmda
- Autor: Severiano Dos Anjos Vilaboa
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 06/11/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Arsenio Fernández López
- Tribunal
- Presidente del tribunal: pablo vicente Escribá ruiz
- diego Ruano caballero (vocal)
- christian Thode (vocal)
- Javier Vitorica ferrández (vocal)