Tesis doctoral de Marc Yeste Oliveras
La adición de distintas sustancias en las dosis seminales se ha descrito como estrategia para la mejora de la calidad espermática en refrigeración y en congelación. La prostaglandina f2¿ (pgf2¿) es una hormona que se ha utilizado para aumentar el rendimiento reproductivo en porcino. Por ello, el presente estudio ha determinado, mediante los análisis de viabilidad, motilidad, morfología y aglutinación espermáticas, así como de la integridad de la vaina mitocondrial y del acrosoma y de la resistencia osmótica de los espermatozoides, que la adición de la pgf2¿ en un rango de concentraciones de 2,5 a 10 mg/100 ml no produce daño alguno sobre la calidad espermática del semen refrigerado a 15ºc. Además, parece que la adición de esta hormona a una concentración de 5 mg/100 ml mantiene la viabilidad espermática en mejores condiciones que el resto de tratamientos. Aparte de los efectos de la pgf2¿, en el presente estudio se ha determinado que el ácido hialurónico en concentraciones de 50 y 100 µg¿ml-1 retrasa la capacitación espermática en refrigeración a corto plazo (hasta tres días), sin que se vean, por ello, afectados los demás parámetros espermáticos analizados. Este retraso es más evidente, aún, cuando se compara con el comportamiento de los espermatozoides después de la adición de cafeína. Así, la pgf2¿ y el ácido hialurónico pueden ser añadidos a las dosis seminales refrigeradas y destinadas a inseminación artificial en determinadas concentraciones, sin que se produzcan daños en la calidad espermática, y además éste último retrasa la capacitación de los espermatozoides después de dos días de conservación a 15ºc dado que se han desarrollado un elevado número de trabajos con el objetivo de predecir la capacidad fecundante de un eyaculado, el presente estudio ha evaluado, también, el efecto de los cambios en la osmolalidad del medio (de 100 a 4000 mosm¿kg-1) sobre los espermatozoides de verraco. En este sentido, se ha observado que dichos cambios producen graves daños en los parámetros espermáticos funcionales, especialmente en las condiciones de estrés osmótico más extremas. Además, la tolerancia de los espermatozoides a estos cambios ha sido utilizada también como un parámetro funcional y se ha demostrado que, en algunos casos, dicha tolerancia se halla correlacionada con las pruebas de fertilidad y prolificidad in vivo ensayadas, respectivamente, mediante la tasa de no retorno al estro dentro de la 60 días posteriores a las primeras inseminaciones (nrr60d) y el tamaño de la camada (ls), y que puede ser aun incluida en modelos de regresión lineal múltiple. Con todo, la resistencia osmótica de los espermatozoides a los cambios de osmolalidad del medio (definida como el cuociente del tratamiento y el control negativo) está mejor correlacionada con las nrr60d y los ls y presenta mayores coeficientes de determinación (r2) en tres de los tratamientos ensayados (hipotónico a 150 mosm¿kg-1 y sin retorno a las condiciones isotónicas, hipotónico a 200 mosm¿kg-1 y con retorno, e hipertónico con citrato sódico a 500 mosm¿kg-1 y sin retorno a la solución isotónica). las células epiteliales del oviducto (oecs) afectan a los parámetros celulares espermáticos como consecuencia del contacto directo entre ambos tipos celulares y de la actividad secretora de estas células somáticas, tal y como se ha observado en este estudio. En realidad, en el cuarto capítulo se han investigado los efectos del cocultivo homólogo con células oviductales sobre los parámetros funcionales de los espermatozoides, las diferencias en la expresión de algunos genes entre las fases folicular y luteal de dichas células, los efectos de la presencia de espermatozoides sobre la expresión de estos mismos genes en las células oviductales después de cocultivo in vitro, y los efectos que produce sobre la viabilidad espermática el silenciamiento del gen que codifica para la proteína de choque térmico alfa a.1 de 90 kda (hsp90aa1). como se ha demostrado, el cocultivo con células epiteliales del oviducto mantiene la motilidad y la viabilidad espermáticas, especialmente en aquellas poblaciones de espermatozoides que se hallan unidas a estas células epiteliales, e induce la capacitación espermática. Los efectos de estas células oviductales se observan también después de incubar los espermatozoides con el medio condicionado por dichas células, aunque no en la misma medida que el cocultivo. Ello sugiere, en fin, que el contacto directo de los espermatozoides con las células epiteliales del oviducto es necesario para la prolongación de la viabilidad espermática en porcino, de acuerdo con la formación del reservorio seminal in vivo. por otra parte, no se observan diferencias significativas entre la fase folicular y la fase luteal de las células epiteliales del oviducto cuando se analiza la expresión de cuatro genes relevantes (clusterina, hsp90aa1, hspa8 y hspa5), los productos proteicos de los cuáles fueron previamente identificados en una fracción soluble de 70 kda, preparada a partir de las membranas plasmática apicales de dichas células. Además, la presencia de espermatozoides sobreexpresa los genes hsp90aa1, hspa8 y hspa5, todos ellos pertenecientes al grupo de genes que codifican para las proteínas de choque térmico, sin afectar la expresión del gen que codifica para la clusterina, de modo que ello sugiere que dichas proteínas juegan algún papel en los procesos reproductivos que tienen lugar al oviducto. finalmente, de entre estas proteínas, se han estudiado los efectos del silenciamento del gen hsp90aa1 en el mantenimiento de la viabilidad espermática mediante las técnicas de la interferencia del rna y del cocultivo in vitro. Después de transferir las moléculas cortas y de cadena doble de rna (sirna) necesarias para inducir este mecanismo, mediante la electroporación in vitro (puesto que la transfección no es efectiva en el cultivo primario de células oviductales), no se han observado cambios en la viabilidad espermática comparando las células que tienen el gen hsp90aa1 silenciado de las que no lo tienen. Este resultado permite concluir que la hsp90aa1 no prolonga la viabilidad espermática. A pesar de ello, otros trabajos han sugerido que esta proteína juega algún papel en la capacitación espermática, de modo que en estudios futuros se podría tener en cuenta dicho aspecto y ensayar los efectos del silenciamiento sobre este parámetro funcional.
Datos académicos de la tesis doctoral «New insights into boar sperm functional and survival from integrated laboratory and field studies«
- Título de la tesis: New insights into boar sperm functional and survival from integrated laboratory and field studies
- Autor: Marc Yeste Oliveras
- Universidad: Girona
- Fecha de lectura de la tesis: 17/12/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Sergi Bonet Marull
- Tribunal
- Presidente del tribunal: merce Durfort coll
- fulvio Gandolfi (vocal)
- paul f Watson (vocal)
- roberto Gualtieri (vocal)