Tesis doctoral de Raul Postigo Fernandez
Abreviaturas abreviaturas 1 resumen en inglés resumen en inglés 7 introducción i-1 la fiebre aftosa 11 i-2 el virus de la fiebre aftosa 13 i-2-1 genoma del vfa 14 i-2-2 proteínas del vfa 15 i-2-3 ciclo infectivo 17 i-2-3-1 internalización celular 17 i-2-3-2 traducción y procesamiento proteolítico 18 i-2-3-3 replicación del arn 20 i-2-3-4 encapsidación y maduración 23 i-2-4 la proteína 3a de los picornavirus 24 i-2-4-1 proteína 3a de poliovirus 27 i-2-4-2 proteína 3a del vfa 29 objetivos objetivos 35 material y métodos m-1 lineas celulares y vírus 39 m-2 clones infecciosos 40 m-3 anticuerpos 41 m-4 cultivo de células 42 m-5 crecimiento de vírus 42 m-6 obtención de adn plasmídico 43 m-7 extracción de arn 43 m-8 clonaje molecular: clones infecciosos de la proteína 3a 43 m-8-1 metodología empleada para la construcción de los clones infecciosos mutantes 45 m-8-1-1 deleción de la proteína 3a del vfa. Mutante pmt28- 3a 45 m-8-1-2 mutante de inserción pmt28-g-3a-g 47 m-8-1-3 mutante de inserción pmt28-g-3a 48 m-8-1-4 sustitución de la proteína 3a por su homóloga del vre-a. 48 mutantes pmt28-3a-vre-c y pmt28-3a-vre-i m-8-1-5 mutantes puntuales 49 m-9 construcción de plásmidos derivados del prsv portando versiones 51 mutadas de la proteína 3a del vfa m-10 transcripción in vitro 52 m-11 transfección en cultivos celulares 53 m-11-1 transfección con arn 53 m-11-2 transfección con adn 53 m-12 titulación de virus 53 m-13 determinación de la infectividad esppecífica del arn de los mutantes. 54 m-14 traducción in vitro 54 m-14-1 cuantificación de incorporación de radiactividad 54 m-14-2 análisis de las proteínas marcadas con 35s mediante electroforesis en gel de poliacrilamida 55 m-15 ensayo de sensibilidad a brefeldina a 55 m-16 condiciones empleadas en las amplificaciones por pcr 55 m-16-1 rt-pcr 56 m-16-2 pcr en tiempo real 56 m-17 inmunoensayos 57 m-17-1 western-blot 57 m-17-2 inmunoprecipitación 58 m-17-3 inmunofluorescencia 59 m-18 ensayo de letalidad en ratón lactante 59 m-19 métodos estadísticos y tratamiento de datos 60 m-20 disoluciones y tampones 60 m-21 oligonucleótidos 61 resultados r-1 construcción de clones infecciosos del vfa para la obtención de virus mutantes en 3a 65 r-1-1 mutantes de delección 66 r-1-2 mutantes de inserción 67 r-1-3 mutantes de reemplazo de 3a 68 r-1-4 mutantes puntuales 71 r-2 síntesis y procesamiento in vitro de la poliproteína viral de los distintos mutantes de 3a 74 r-3 infectividad del arn de mutantes de 3a en cultivos celulares 78 r-3-1 citopatogenicidad de mutantes de 3a en células bhk-21 78 r-3-2 citopatogenicidad de mutantes de 3a en células vero 81 r-3-3 producción de virus infectivos a partir del arn de los mutantes de la proteína 3a 82 r-3-3-1 infectividad específica del arn de los mutantes de 3a 82 r-3-3-2 cuantificación de la producción viral de mutantes de la proteína 3a 84 r-3-4 expresión de proteínas virales de los mutantes de la proteína 3a en cultivos celulares 86 r-3-4-1 análisis mediante western-blot 86 r-3-4-2 análisis por inmunofluorescencia de productos virales en células transfectadas con arn de mutantes de la proteína 3a 89 r-3-5 estudio de la expresión transitoria de las proteínas mutadas en los residuos l38e y l41e 92 r-3-6 análisis de la producción de arn viral en células transfectadas con arn de mutantes de 3a 94 r-3-6-1 detección de la producción de arn viral por rt-pcr semicuantitativa 94 r-3-6-2 rt-pcr a tiempo real 95 r-4 evaluación de la posible complementación en trans de mutantes de la proteína 3a 97 r-4-1 producción de ecp por arn de mutantes de la proteína 3a en clones celulares que expresan 3a o 3abbb 98 r-4-2 producción viral de mutantes de la proteína 3a en clones celulares que expresan 3a o 3abbb 101 r-5 patogenicidad de los arns de mutantes de 3a en ratón lactante 103 discusión d estudio funcional de la proteína 3a 109 d-1 mutantes de deleción de 3a 111 d-2 mutantes de sustitución por la proteína 3a del vre-a 115 d-3 mutantes de inserción 117 d-4 mutante pmt28-c65s 120 d-5 mutantes pmt28-q44r y pmt28-q44d 120 d-6 mutantes pmt28-l38e y pmt28-l41e 122 d-7 consideraciones finales 124 conclusiones conclusiones 129 bibliografía bibliografía 133 anexo rosas, m. F., Y. A. Vieira, r. Postigo, m. A. Martin-acebes, r. Armas-portela, e. Martinez-salas, and f. Sobrino. 2008. Susceptibility to viral infection is enhanced by stable expression of 3a or 3ab proteins from foot-and-mouth disease virus. Virology 380:34-45.
Datos académicos de la tesis doctoral «Analisis funcional de la proteina 3a del virus de la fiebre aftosa«
- Título de la tesis: Analisis funcional de la proteina 3a del virus de la fiebre aftosa
- Autor: Raul Postigo Fernandez
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 16/10/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Francisco Sobrino Castello
- Tribunal
- Presidente del tribunal: esperanza Gomez-lucia duato
- Juan Carlos Sáiz calahorra (vocal)
- José ignacio Núñez garrote (vocal)
- alejandro Brun torres (vocal)