Tesis doctoral de Esther Patricia Garcia Tirado
El gen lrpc de bacillus subtilis, que ha sido caracterizado como un gen no esencial, posiblemente regula el metabolismo de aminoácidos celular y disminuye el tiempo de entrada en fase de esporulación (beloin et al., 1997). Lrpc es capaz de autoregular su propia expresión (beloin et al., 2000). Lrpc es una proteína de unión a dna independiente de secuencia, presentando una mayor afinidad por dna de doble cadena curvado, aunque es capaz de unirse a un amplio rango de tipos de dna. Teniendo en cuenta estos datos bioquímicos se ha propuesto un posible papel de lrpc como proteína arquitectural, lo que viene avalado por los datos de microscopía de fuerzas atómicas que revelan la unión de lrpc al dna formando los denominados ¿nucleosomas¿ celulares (beloin et al., 2003). La resolución del cristal de lrpc revela un octámero en estructura cruciforme, que se uniría al dna curvándolo y compactándolo (thaw et al., 2006). En b.Subtilis, el gen topb, que se encuentra aguas abajo del gen lrpc, codifica para la proteína topoisomerasa iii. Esta proteína pertenece a la superfamilia de las topoisomerasas tipo ia. El mecanismo de acción de las topoisomerasas en general consiste en la ruptura de una o las dos hebras del dna mediante el ataque nucleofílico de la tirosina del centro activo de la enzima al fosfato del esqueleto del dna. la forma en la que se lleva a cabo dicha función ha llevado a clasificar a las topoisomerasas en dos familias denominadas tipo i (cortan una hebra del dna) y tipo ii (cortan las dos hebras del dna). Nos centraremos en las topoisomerasas tipo ia, que comprenden topo i y iii de procariotas y topo iii de eucariotas. Estas enzimas crean un enlace 5¿-fosfotirosil con el dna, cortando una de las hebras del dna, lo que les permite relajar un dna inicialmente superenrollado (depew et al., 1978; liu and wang, 1979; tse et al., 1980). Topo iii de e.Coli ha sido caracterizada como una enzima capaz de decatenar intermediarios tardíos de tipo ¿ del plásmido pbr322 (digate and marians, 1988). Sin embargo, a diferencia de topo i, relaja probremente un dna superenrollado, a una temperatura óptima de 52°c (digate and marians, 1988). Junto con la helicasa recq, topo iii es capaz de resolver horquillas de replicación convergentes, y esto se ha demostrado que se realiza por interacción física entre ambas, mediada por la interacción por separado de cada una de ellas con la proteína ssb (suski and marians, 2008). La proteína más similar a topo iii de b.Subtilis es topo iiiíY de bacillus cereus, con la que presenta un 64% de identidad de secuencia. Esta enzima presenta un máximo de actividad de relajación a 52ºc y ph óptimo de 9.8 y no es capaz de relajar totalmente un dna superenrollado (li et al., 2006). Topo iiiíY no es capaz de compensar la pérdida de topo iii de e.Coli in vivo, lo que probablemente indica que se trata de una nueva topoisomerasa con una función distinta en la célula. En general, las topoisomerasas tipo iii han sido asociadas a procesos de recombinación de dna, como en el caso de topo iii de e.Coli, la cual podría tener un papel in vivo como ruta alternativa de disolución de la holliday junction (lopez et al., 2005). El proceso de recombinación homóloga en b.Subtilis es un proceso altamente organizado. Una de las razones por las que se activa es como consecuencia de un daño en el dna, como roturas de doble cadena. Cuando esto ocurre, el daño es reconocido y procesado por nucleasas específicas, generando un extremo de cadena sencilla, que será reconocido por la proteína central de la recombinación, reca, que se encarga del intercambio de cadenas entre dos dna homólogos. Como consecuencia de su acción, se formará un intermediario de recombinación denominado holliday junction, que deberá ser procesado por el resolvasoma ruvab-recu. De esta forma se generan dos moléculas hijas donde ha ocurrido un intercambio de material genético para reparar el daño. Se desconoce si topo iii tiene algún papel en una ruta alternativa a la resolución de ruvab-recu (al igual que en e.Coli), en la cual y con la ayuda de una helicasa tipo recq (recq o recs) la holliday junction sería disuelta y como consecuencia las dos moléculas hijas no intercambiarían material genético (fig. 9). el proceso de recombinación homóloga en b.Subtilis se encuentra asociado al de competencia celular, con proteínas que participan en ambos procesos, como reca, ssb, reco, recu y recn. durante el estado de competencia natural de b.Subtilis, el dna exógeno es incorporado al interior de la célula mediante la maquinaria localizada en la pared celular conocida como proteínas ¿com¿. el dna, que entra en forma de cadena sencilla, es recubierto por ssb y procesado por reca para comenzar con un evento de recombinación (chen et al., 2005) uno de los objetivos propuestos para la presente tesis doctoral fue el de dilucidar el papel in vivo de lrpc. Para ello, se determinaron los niveles intracelulares de la proteína en distintos momentos del ciclo celular y en diferentes medios de crecimiento. Lrpc presenta una mayor abundancia al final de la fase exponencial, pero no se encuentran diferencias entre medio rico o medio mínimo. los resultados obtenidos descartan que lrpc sea un regulador global en b.Subtilis, inclinándose más bien hacia un papel en regulación local. La fusión fluorescente gfp-lrpc ha permitido determinar la localización in vivo de dicha proteína. En crecimiento vegetativo, en fases exponencial y estacionaria, lrpc se encuentra formando un patrón específico de foci dentro o en los bordes del nucleoide, y en algunos casos formando agregados coincidentes con el mismo. Esta localización en foci y no decorando todo el nucleoide, cuyo patrón además varía según el crecimiento y medios de cultivo empleados, indica que lrpc puede tener un papel específico durante el crecimiento celular, presentando una localización cercana a los centros de transcripción situados en la periferia del nucleoide. Sin embargo, en competencia celular, lrpc presenta un patrón de localización polar en la célula, lo cual sugiere un rol en transformación. Esto se ha visto confirmado con el descenso al 50% en transformación plasmídica del mutante nulo lrpc en comparación con la cepa silvestre. Por lo tanto lrpc podría presentar un pequeño papel en competencia celular. Los genes lrpc y topb se encuentran localizados en el mismo operón y se transcriben bajo el mismo promotor. Lrpc estimula la actividad relaxasa de topoisomerasa iii, aunque no se ha detectado una interacción directa proteína-proteína. el gen topb de b.Subtilis ha sido caracterizado por primera vez. La morfología celular y del nucleoide del mutante nulo topb no presenta diferencias respecto a la cepa silvestre. El mutante nulo topb presenta una viabilidad celular muy similar a la de la cepa silvestre tras inducir daño por mms. Sin embargo, tras la inducción de daño por dicha droga, la mutación sencilla topb combinada con mutación en algunos genes implicados en rutas presinápticas de la recombinación (recf, reco, addab y recj) recuperan parcialmente su viabilidad respecto a la de cada mutante sencillo por separado más sensible. El doble mutante recutopb, sin embargo, presenta una viabilidad más reducida que la del mutante sencillo recu, lo cual lleva a sugerir que ambos genes se encuentran actuando en la última etapa de la recombinación homóloga participando en distintas vías de resolución. Esta hipótesis se ha visto reforzada por el hecho de que el mutante doble recutopb presenta un mayor número de células anucleadas y filamentadas respecto al mutante sencillo recu. Cuando se utiliza otro compuesto que causa daños en el dna como el h2o2, el mutante sencillo topb presenta una ligera disminución de la viabilidad celular con respecto a la cepa silvestre. Los dobles mutantes addabtopb, recftopb y recotopb recuperan parcialmente la viabilidad celular respecto a la de los mutantes sencillos por separado addab, recf y reco. El doble mutante recqtopb presenta el mismo fenotipo que el mutante sencillo recq, mientras que recstopb es menos sensible que el mutante sencillo recs, lo cual sugiera que topo iii actuaría en la misma ruta que recq y distinta de recs. El doble mutante recutopb presenta un fenotipo sinérgico respecto al mutante sencillo recu, al igual que en presencia de mms. Todos estos datos llevan a proponer un papel de topoiii en etapas tardías de la recombinación homóloga. La fusión fluorescente topoiii-yfp presenta una localización celular citosólica o polar, y no se observan foci específicos en los centros de reparación tras la inducción de daño del dna por mmc. La proteína topoisomerasa iii de b.Subtilis ha sido purificada y caracterizada por primera vez. Se trata de una proteína monomérica de 80 kda aproximadamente. La actividad relacionada con dicha proteína permite clasificarla como una relaxasa de dna superenrollado, que presenta dicha actividad a ph 9.8 y una temperatura de 52ºc. Topoiii es capaz de unirse con mayor afinidad a cualquier tipo de dna en presencia de 1 mm mgcl2. También se une con mayor afinidad a las estructuras de recombinación que a un dna de cadena doble o sencilla, indicando un posible papel en recombinación homóloga. Topo iii por sí sola no puede cortar el intermediario de cuatro cadenas que se produce en recombinación, la holliday junction, por lo que se estima necesaria la participación de una proteína accesoria para dicha actividad, en caso de que topo iii pudiera disolver dicha estructura. Sin embargo, topo iii corta específicamente el primer intermediario de recombinación, producto de la invasión de un dna de cadena sencilla en un dna homólogo de cadena doble (denominado d-loop). las conclusiones obtenidas durante la presente tesis doctoral son: 1. Los niveles proteicos de lrpc no presentan una variación entre medio rico y medio mínimo, pero sí entre fases de crecimiento, presentando un máximo al final de la fase exponencial. Lrpc no puede ser considerado un regulador global como su homólogo en e.Coli. Al final de la fase exponencial en medio rico, lrpc modula la expresión de tan solo 26 genes, lo que supone un 0.6% del genoma total. 2. La localización in vivo de gfp-lrpc durante el crecimiento vegetativo muestra dos patrones principales, presentando foci discretos o agregados coincidentes con el nucleoide, que a su vez varían según el medio de crecimiento empleado. En medio mínimo en crecimiento exponencial, gfp-lrpc presenta dos focos simétricos coincidentes con el nucleoide o uno asimétrico en los bordes del nucleoide. Este patrón de focos está situado más cerca de los polos celulares en crecimiento estacionario. En medio mínimo de competencia, gfp-lrpc se localiza mayoritariamente en focos polares. 3. Lrpc no es una proteína reclutada a los centros de reparación después de daño por mmc. La localización polar de gfp-lrpc en fase de competencia natural permite sugerir un papel en dicho proceso, confirmado por el defecto en transformación plasmídica presentado por el mutante nulo lrpc. 4. Los genes lrpc y topb de b.Subtilis conforman un único operón y por lo tanto son transcritos a partir del mismo promotor. Lrpc estimula la actividad de relajación de topo iii, aunque no se pudo detectar una interacción directa entre ambas. 5. El mutante nulo topb presenta una morfología celular y de nucleoide similar a la cepa silvestre. el doble mutante recutopb presenta 3 veces más de células enucleadas en comparación con el mutante sencillo recu. 6. Cuando se introduce un daño de dna por mms o por h2o2, la viabilidad celular del mutante sencillo topb es similar a la de la cepa silvestre. Dobles mutantes de topb con genes presinápticos addab, recj, reco y recf recuperan su viabilidad parcialmente respecto a la de los mutantes sencillos addab, recj, reco y recf, respectivamente. El doble mutante recutopb presenta una mayor sensibilidad al daño por mms que el mutante sencillo recu. Topoiii está implicada en reparación de dna por recombinación homóloga, pudiendo desarrollar una actividad antirecombinasa y de resolución de d-loops. El análisis genético parece indicar que topoiii sería epistático con recq, mientras que con recs sólo sería epistático en caso de daño por mms. 7. La fusión topo iii-yfp se encuentra localizada en el citosol celular, a diferencia de recq y recs que localizan en foci discretos coincidentes con el nucleoide. Topo iii no forma parte de las proteínas que son reclutadas a los centros de reparación tras inducir daño por mmc. 8. Topoisomerasa iii de b.Subtilis es un polipéptido monomérico de 80 kda. Presenta actividad característica de relajación parcial de plásmido superenrollado con unas condiciones de 52ºc y ph 9.8. 9. Topoiii se une a intermediarios de recombinación con 6 veces más de afinidad que a dna de cadena doble o sencilla en presencia de mg 2+ . En presencia de edta, topoiii se une con menor afinidad a estas estructuras. Topoiii no realiza el corte de la hj in vitro en las condiciones probadas. 10.Topoiii corta específicamente d-loops, intermediarios de recombinación que se forman durante la sinapsis. El mutante nulo topb presenta un defecto en transformación cromosomal que apoya.
Datos académicos de la tesis doctoral «In vivo and in vitro studies of the lrpc-topb operon of bacillus subtilis.«
- Título de la tesis: In vivo and in vitro studies of the lrpc-topb operon of bacillus subtilis.
- Autor: Esther Patricia Garcia Tirado
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 16/11/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Silvia Ayora Hirsch
- Tribunal
- Presidente del tribunal: josé Berenguer Carlos
- enrique Viguera mínguez (vocal)
- eduardo González pastor (vocal)
- graciela Pucciarelli morrone (vocal)