Tesis doctoral de María Lourdes Renart Pérez
Las proteínas de membrana, entre ellas los canales de potasio, son componentes muy importantes de todos los organismos vivos debido a su implicación en los principales procesos biológicos y a su potencialidad como dianas de distintos fármacos. El canal de potasio kcsa se identificó y clonó en 1995 a partir de la bacteria streptomyces lividans. Esta proteína presenta similitud funcional con muchos otros canales de potasio eucariotas y muestra a su vez una elevada homología con el canal eucariota kv2.1. Los estudios cristalográficos demostraron que kcsa es un homotetrámero organizado alrededor de un poro central que contiene el denominado filtro de selectividad. Existen además dos segmentos transmembrana y dos dominios citoplasmáticos (n y c terminales). El tetrámero es capaz de auto-ensamblarse en estructuras de peso molecular superior (clusters), tanto in vitro como in vivo. Esta variabilidad estructural se ve reflejada a su vez en una variabilidad funcional en la conducción y bloqueo del canal. Los estudios sobre plegamiento demostraron que el alcohol 2,2,2-trifluoroetanol (tfe) es capaz de desplegar y disociar al canal en sus monómeros constituyentes. Este proceso es parcialmente reversible en detergente (ddm) y completamente reversible en sistemas de micelas mixtas detergente/lípido. Recientemente ha sido descripto la inactivación rápida (tipo n) de kcsa por péptidos procedentes del canal eucariota shaker b. Esta investigación tiene como objetivos profundizar en la investigación de los mecanismos de modulación del canal de k+ kcsa por iones conductores y bloquedores, tanto a nivel de su ensamblaje supramolecular y acoplamiento, su plegamiento y estabilidad o su interacción con lípidos de membrana. Dado que se ha descripto la interacción de diferentes iones con kcsa, se comprobó el efecto de cationes conductores y bloqueadores sobre la estructura y estabilidad del canal mediante la siguientes técnicas: espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia de infrarrojo por transformada de fourier, dicroismo circular, sds-page, entre otras. La funcionalidad del canal se analizó utilizando la técnica de parche escindido (patch-clamp) en liposomas gigantes de asolectina. Se utilizaron la proteína salvaje (kcsa wild type) y diferentes mutantes obtenidos previamente por ingeniería genética, que nos permitieron identificar zonas de la proteína asociadas a potenciales cambios en la estructura en diferentes situaciones iónicas. Los resultados obtenidos indican que la interacción de kcsa silvestre con k+ y na+ induce ligeras modificaciones en la estructura secundaria y terciaria del canal, que conducen a variaciones muy importantes en la estabilidad proteica, tanto química como térmica. La unión de k+ a kcsa silvestre induce la formación consecutiva de un estado no conductor, de elevada afinidad por el catión; y de un estado conductor, de baja afinidad y elevada estabilidad química y térmica; mientras que la unión de na+ a kcsa silvestre se caracteriza por la formación de un único estado no conductor, de modera estabilidad química y térmica. Los cambios estructurales y de estabilidad observados en kcsa se originan en el equilibrio entre conformaciones conductoras y no conductoras del filtro de selectividad, confirmado a través de las mutaciones puntuales e71a y m96v, que afectan la estructura y estabilidad de kcsa a través de la alteración del equilibrio conformacional del filtro de selectividad y sus consecuencias sobre la interacción con na+ y k+. La modificación del equilibrio conformacional del filtro de selectividad a través de las mutaciones e71a y m96v conduce a modificaciones en la conducción iónica y en la selectividad k+/na+. Por otra parte, la unión de fosfolípidos de carga negativa neta y de alquilsulfatos de 12 a 14 carbonos a los sitios no anulares de kcsa induce una elevada estabilización térmica del canal, promovida por el establecimiento de interacciones específicas con ciertos aminoácidos, entre los que destacan las argininas 64 y 89. por lo tanto, los iones actúan como efectores de kcsa actuando como cofactores alostéricos, favoreciendo o desfavoreciendo una determinada conformación proteica y manteniendo unidas las subunidades del canal a través de las múltiples interacciones establecidas con la cavidad central y, principalmente, con el filtro de selectividad. los fosfolípidos de carga negativa, por otra parte, actúan como efectores de kcsa contribuyendo al mantenimiento de una estructura tetramérica estable y actuando como efectores alostéricos de la conformación del filtro de selectividad, optimizando las interacciones que dan lugar al estado nativo conductor.
Datos académicos de la tesis doctoral «Iones y fosfolípidos como efectores en la estructura y estabilidad del canal de potasio kcsa«
- Título de la tesis: Iones y fosfolípidos como efectores en la estructura y estabilidad del canal de potasio kcsa
- Autor: María Lourdes Renart Pérez
- Universidad: Miguel hernández de elche
- Fecha de lectura de la tesis: 16/12/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Francisco Javier Gomez Perez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: José manuel Sanchez ruiz
- pilar De la peña cortines (vocal)
- vicente Micol molina (vocal)
- rosa María Planells cases (vocal)