Tesis doctoral de Laia Canela Pujol
El glutamato, actuando a través de sus receptores ionotrópicos y metabotrópicos, constituye el neurotransmisor excitativo más importante en el sistema nervioso central de los mamíferos mediando el procesamiento de información básica del cerebro. La dopamina, actuando a través de sus gpcrs específicos, sirve como importante neurotransmisor en las neuronas del snc involucradas en la función motora y otras funciones cerebrales. La adenosina, actuando también a través de gpcrs específicos, es el neuromodulador clave que regula muchas funciones neurológicas. El objetivo principal de esta tesis fue avanzar en el conocimento de los mecanismos funcionales implicados en la acción del glutamato, la dopamina y la adenosina en el sistema nervioso central. los receptores de adenosina del sistema nervioso central están implicados en la regulación de distintos patrones de comportamiento y funciones cognitivas, sin embargo, el papel de uno de los subtipos de estos receptores, el receptor a2a de adenosina, en aprendizaje y memoria todavía no está claro. Se creó una nueva cepa de rata transgénica, tgr (nseha2a), que sobreexpresa el receptor de adenosina principalmente en el cortex cerebral, el hipocampo y el cerebelo y se exploró la relevancia de esta sobreexpresión en las funciones de aprendizaje y memoria. Se evaluó la conducta de estos animales en varias tareas de aprendizaje y memoria (laberinto radial de 6 brazos, laberinto t, reconocimento de objetos y varios paradigmas de laberinto de agua de morris) y otras pruebas para evaluar la actividad motora espontánea (campo abierto, laberinto hexagonal de túneles) y la ansiedad (laberintos positivos), ya que la modificación de estas conductas podría interferir en la evaluación de la función cognitiva. La sobreexpresión del receptor a» de adenosina no alteró la función motora ni las conductas emocional y de ansiedad de las ratas tgr, que a su vez mostraron unos niveles normales de aprendizaje dependiente de hipocampo y memoria de referencia espacial. Sin embargo, las ratas tgr presentaron déficits de memoria de trabajo detectados por errores constantes en los brazos ciegos del laberinto radial de 6 brazos, reducción del reconocimento de un objeto nuevo y una falta de mejora en aprendizaje después de 4 ensayos en un mismo dia, lo cual no se observó en dias consecutivos mediante el laberinto de agua de morris. Dada la interdependencia entre las funciones adenosínica y dopaminérgica, estos resultados apoyan la posibilidad de utilizar las ratas tgr (nseha2a) como modelo animal para déficits de memoria de trabajo y trastorno cognitivo relacionado con la sobreexpresión de los receptores a« de adenosina corticales o con la disfunción prefrontal dopaminérgica, tal y como se ha observado en pacientes con esquizofrenia o parkinson. el concepto de maquinaria de transducción de señal de los gpcr se ha desarrollado recientemente. La idea simplista que considera al receptor como una unidad funcional que sólo interacciona con su ligando y sistema efector se ha desarrollado hasta llegar a una concepción de transducción de señal mucho más compleja. Estos mecanismos de transducción de señal incluyen la formación de complejos multiproteicos en los que participan interacciones receptor-receptor y receptor-proteína intraceluar. Así pues, nos plantemos el objetivo de ¡identificar proteínas intracelulares que interaccionaran con la cola c-terminal del receptor humano a2a de adenosina y dilucidar si la interacción es relevante para la función del receptor. Mediante un cribado de doble híbrido se indentificó necab2, una proteina neuronal de unión a calcio, como proteína de unión al receptor a2a de adenosina (a^r) interaccionando con su dominio c-terminal. Experimentos de colocalización, coinmunoprecipitación y pull-down mostraron una interacción directa y específica entre a^r y necab2 en células hek-293 transfectadas y también en estriado de rata. La detección de necab2 y a2ar en estructuras estriatopalidales de rata mediante microscopía inmunoelectrónica indicó que ambas proteínas están codistribuidas en las mismas terminales nerviosas glutamatérgicas. La interacción de necab2 con a2ar modula la expresión del receptor en la superficie celular, su internalización dependiente de ligando y la activación mediada por receptor de la via de las mapk. En conjunto, estos resultados muestran que a^r interacciona con necab2 en neuronas estriatales que coexpresan ambas proteínas y que la interacción es relevante para la función de a2ar. por otro lado, también nos plantemos identificar proteínas de unión al receptor metabotrópico de glutamato mglu5 y analizar si modulan también la función del receptor. Mediante un cribado de doble-híbrido en levadura, se identificó la unión entre a-actinina-1, «a major f-actin cross-linking protein», y el dominio c-terminal del receptor metabotrópico de glutamato del tipo 5b (receptor mglu5b). Experimentos de coexpresión, coinmunoprecipitación y pull-down demostraron una interacción próxima y específica entre el receptor mglu5b y a-actinina-1 en células hek-293 transfectadas y estriado de rata. La interacción de a-actinina-1 con el receptor mglu5b modulaba la expresión del receptor en la superficie celular, que a su vez dependía de la interacción de a-actinina-1 con el citoesqueleto de actina. Además, la interacción a-actlnina-1/receptor mglu5b regulaba la activación mediada por receptor de la via de las proteínas kinasas activadas por mitógenos. En conjunto, estos resultados indican que hay una asociación entre mglu5b y el citoesqueleto de actina dependiente de a-actinina-1 que modula la función y la expresión del receptor en la superficie celular. existen evidencias de la interacción entre los receptores a2a de adenosina y mglu5 de glutamato, sin embargo todavía se desconoce si esta interacción es directa o indirecta. Nos planteamos dilucidar si los receptores am de adenosina y mglu5 de glutamato comparten alguna proteína de unión. Pudimos demostrar la interacción específica entre el receptor mglu5b y necab2, tanto en células hek-293 transfectadas como en hipocampo de rata. Experimentos de pull-down mostraron que concentraciones crecientes de calcio reducían drásticamente la habilidad de estas proteínas para interaccionar entre ellas. Se detectaron necab2 y el receptor mglu5b en la formación de hipocampo de rata mediante microscopía inmunoelectónica, mostrando la co-distribución de ambas proteínas en los mismos compartimentos subcelulares de las células piramidales. Por otro lado, la interacción entre necab2 y el receptor mglu5b regula la activación de la vía de las mapk mediada por el receptor. Estos resultados indican que necab2 interacciona físicamente con el receptor mglu5b de glutamato y modula su funcionalidad. existen muchos datos que evidencian la existencia complejos de receptores homoméricos y heteroméricos funcionales, que involucran receptores acoplados a proteína g (gpcr), incluyendo los receptores a2a de adenosina, d2 de dopamina y mglu5 de glutamato. El papel de estos complejos en la función de los receptores parece ser múltiple, incluyendo la heteromodulación del reconocimiento de ligando, la señalización y el tráfico. En este capítulo estudiamos las interacciones de los receptores a¡a de adenosina (a2ar)-d2 de dopamina (d2r)-metabotróp¡co de glutamato 5 (mglu5r) en estriado a nivel transcripcional mediante el estudio comparativo entre la activación individual y conjunta de estos receptores. Encontramos 164 genes con un patrón de expresión distinto con la activación conjunta de a^r, d2r y mglu5r respecto a ¡a activación individual de cada receptor. Entre estos genes, nos centramos en el de la 6-sinucleína, ya que sus niveles se veían aumentados con el triple tratamiento pero sin embargo no estaban modificados con el tratamiento individual. Dado que la p-sinucleína es una molécula endógena que actúa de forma protectora contra la neuropatología de a-sinucleína y que la activación conjunta los receptores a2a, d2 y mglu5 da lugar a un aumento de p-sinucleína, podemos hipotetizar un papel neuroprotector del complejo de receptores a2ar-d2r-mglu5r inducido por la sobreexpresión de p-sinucleína. la diversidad de redes proteicas asociadas a los gpcrs genera una complejidad inesperada que hace más difícil la comprensión de la fisiología de estos receptores. Sin embargo, la diversidad y especificidad de estas redes ofrece la oportunidad de descubrir nuevos mecanismos para el control de la oligomerización y función de los gpcr, por lo que todavía queda mucho camino por recorrer en la investigación de estas interacciones.
Datos académicos de la tesis doctoral «Plasticidad molecular de los receptores acoplados a proteínas g en el sistema nervioso central«
- Título de la tesis: Plasticidad molecular de los receptores acoplados a proteínas g en el sistema nervioso central
- Autor: Laia Canela Pujol
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 01/04/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Enric Canela Campos
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Carlos Ciudad gómez
- olga Valverde granados (vocal)
- (vocal)
- (vocal)