Tesis doctoral de Begonya Morales Juan ós
Las enzimas e3 o ligasas de ubiquitina son las encargadas de seleccionar y marcar con ubiquitinas numerosas proteínas para alterar su localización celular o para enviarlas al proteosoma para su degradación. Estas enzimas reconocen el sustrato y catalizan la unión covalente de varias unidades de ubiquitina a la proteína diana. De esta manera el sustrato unido a la cadena de poliubiquitinas queda marcado para su posterior degradación en el proteosoma. Fallos en alguno o varios pasos de este proceso conducen a la acumulación o déficit de las proteínas diana. Esta falta de regulación puede dar lugar a cascadas de reacciones descontroladas que terminan originando graves enfermedades. Por ejemplo, se han detectado defectos en el funcionamiento de smurf2 en cáncer de esófago, de wwp1 en cánceres de próstata y de mama y de nedd4 en cáncer de vesícula. En el caso de itch, errores en su funcionamiento contribuyen al desarrollo de enfermedades autoinmunes ya que juega un papel crítico en la diferenciación de células del tipo t. este trabajo se centra en el estudio de las e3 de la familia nedd4. Estas e3 son proteínas modulares cuya composición en dominios se ha mantenido conservada durante la evolución de metazoos, por lo que también se las conoce como ligasas del tipo c2-wws-hectt. Las ligasas tipo nedd4 reconocen sus sustratos mediante interacciones entre sus dominios ww y secuencias con el motivo l/ppxy presentes en los distintos sustratos. Su dominio catalítico c-terminal hect es el que transfiere la ubiquitina a la proteína diana. en esta tesis se ha descrito cómo itch, una e3 tipo nedd4, reconoce 2 sustratos: la proteína de membrana lmp2a del virus epstein-barr y el factor de transcripción junb. Para ello se han utilizado la espectroscopia de rmn y fluorescencia. Se ha resuelto la estructura del tercer dominio ww de itch en complejo con un péptido de la proteína lmp2a y se ha analizado mediante mutaciones puntuales el papel de determinadas interacciones en la formación del complejo. Además se ha estudiado cómo 2 fosforilaciones influyen en el reconocimiento intermolecular. Anteriormente se había demostrado en el mismo laboratorio que la fosforilación de la tirosina del ligando (l/ppxy) disminuye la afinidad del complejo, en este trabajo se estudió como puede ser compensado el impedimento esférico que supone el grupo fosfato en la unión entre las dos proteínas. Estudios recientes demuestran que en la célula esta disminución de la afinidad podría ser suficiente para que las dos proteínas no se unan. hasta la fecha la mayoría de estudios se han centrado en la fosforilación del sustrato como mecanismo de regulación del reconocimiento de la e3 por la proteína diana. En este trabajo se investigó el efecto de la fosforilación del dominio ww de la e3 en una treonina (t30). Este aminoácido está ubicado dos residuos antes del segundo triptófano de los dominios ww y está conservado en la mayoría de los dominios ww como un residuo fosforilable (s/t). Utilizando rmn se demostró que la fosforilación de este residuo inhibe completamente la unión del dominio ww3 de itch al péptido de lmp2a. Mediante experimentos de fosforilación in vitro se comprobó además que existen quinasas capaces de realizar esta fosforilación en diversos dominios ww. La conservación de este residuo como s/t en todos los dominios ww hace pensar que este podría ser un mecanismo de regulación de la interacción de estos dominios con sus sustratos. por otro lado, estudios recientes demostraron la existencia de contactos intramoleculares en itch que fueron interpretados como que el enzima adopta una conformación cerrada inactiva que se abre al sufrir una fosforilación en la secuencia conectora entre el dominio c2 y la zona central que contiene los dominios ww. Las e3 con dominios hect son capaces de actuar sobre sí mismas y parece ser que esta conformación cerrada impide la auto-degradación de estas enzimas. un análisis de secuencias de e3 tipo nedd4 mostró una zona próxima al extremo c-terminal del dominio hect muy conservada que contiene un motivo semejante a los reconocidos normalmente por dominios ww, lppy. Para comprobar si esta región interacciona con un dominio ww de la misma enzima se sintetizó un péptido de 15 residuos con el motivo lppy y se realizaron valoraciones del tercer dominio ww de las e3 itch y de wwp1 en presencia de este péptido. Wwp1 es otra e3 tipo nedd4 cuya estructura del dominio hect ha sido resuelta mediante cristalografía y que presenta una identidad de secuencia del 83 % con itch. Las valoraciones fueron monitorizadas mediante rmn y se observaron cambios de desplazamientos químicos en algunos residuos que indicaron que existe interacción entre los dos dominios ww y el péptido conservado en las e3. posteriormente realizó el clonaje, la expresión y purificación del subdominio de c-terminal del dominio catalítico hect de la proteína wwp1 (130 residuos) y se le añadió el dominio ww3 de wwp1. Los cambios en algunos desplazamientos químicos demostraron que los dos dominios interaccionan. Por último se adquirieron experimentos de triple resonancia del subdominio c-terminal para asignar su esqueleto. De esta manera se identificaron por primera vez los residuos del dominio hect implicados en esta interacción intramolecular que induce una conformación cerrada inactiva de la e3.
Datos académicos de la tesis doctoral «Regulación de las e3 ubiquitina ligasas itch (aip4) y wwp1 (aip5) mediante sus dominios ww«
- Título de la tesis: Regulación de las e3 ubiquitina ligasas itch (aip4) y wwp1 (aip5) mediante sus dominios ww
- Autor: Begonya Morales Juan ós
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 05/03/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María Jesús Macías Hernández
- Tribunal
- Presidente del tribunal: miquel Pons valles
- María concepción Civera tejuca (vocal)
- (vocal)
- (vocal)