Tesis doctoral de Margarita García Calderón
El amonio generado por los procesos de asimilación primaria y secundaria de nitrógeno se asimila gracias a la actuación de dos enzimas que actúan en tándem, la glutamina sintetasa y la glutamato sintasa, que realizan el llamado ciclo de la gs-gogat. La enzima gs de plantas es una proteína octamérica que presenta dos isoformas, una citosólica (gs1) de peso molecular entre 37-43 kda por subunidad, y la isoforma plastídica (gs2) de 43-45 kda por subunidad. En hojas, ambas isoformas están presentes localizadas en el citosol y los cloroplastos, siendo mayoritaria la gs2, mientras que en raíces sólo se detecta normalmente la gs1, si bien, se ha descrito la presencia de gs2 en raíces de leguminosas de clima templado, como es el caso de la leguminosa modelo lotus japonicus, que se caracteriza por asimilar el nitrato preferentemente en las raíces y por la presencia de gs2 en ellas. En nuestro laboratorio se han obtenido y caracterizado dos mutantes fotorrespiratorios de lotus japonicus (ljgln 2-1 y ljgln 2-2) deficientes en la isoforma gs2, aislados de una población de semillas mutageneizadas con ems. Estas plantas mutantes crecían de forma similar a las plantas silvestres cuando eran cultivadas en una atmósfera rica en co2 [0,7% (v/v)] en la cual la fotorrespiración se encontraba suprimida. Sin embargo, cuando las plantas eran transferidas a una atmósfera de aire, las plantas mutantes mostraban síntomas de estrés como clorosis y necrosis, afectando más a las hojas más jóvenes. Si las plantas eran devueltas a la atmósfera de alto co2, recuperaban su fenotipo normal y podían ser así mantenidas y propagadas adecuadamente. En este trabajo se han analizado las consecuencias fisiológicas de la deficiencia de esta isoforma en plantas de lotus japonicus. Las plantas mutantes mostraban una fuerte reducción de la actividad gs biosintética, prácticamente del 80% respecto a la actividad obtenida en plantas silvestres. Los estudios realizados pusieron de manifiesto que la gs2 resultaba esencial en la reasimilación del amonio liberado durante el proceso de la fotorrespiración. Se ha demostrado la gran importancia de este amonio como un elemento crucial del metabolismo fotorrespiratorio, ya que se ha estimado que la pérdida de éste podría sobrepasar en 10 veces (o incluso 100 veces) la tasa calculada de asimilación primaria de nh3 proveniente de la reducción de no3-. Sin embargo, esta isoforma no era esencial en la asimilación primaria de nitrato o amonio en esta planta. El estudio de los niveles de metabolitos nitrogenados y carbonados mediante metaboloma y otras técnicas enzimáticas y hplc, mostraron que la deficiencia en gs2 producía mayores alteraciones sobre los metabolitos carbonados, indicando una situación de limitación de carbono en los mutantes. También se abordaron estudios de nodulación con estas plantas mutantes, demostrando que la gs2 no era una enzima crucial en el proceso de nodulación puesto que las plantas mutantes nodulaban de forma análoga a las plantas silvestres. Sin embargo, estos mutantes eran deficientes en la isoforma de gs2 de nódulos responsable del 40% de la actividad gs en este órgano y esta deficiencia afectaba la simbiosis con mesorhizobium loti alterando el proceso de desarrollo de los nódulos y la fijación de n2 en condiciones de aire, dando lugar a graves alteraciones en el proceso de nodulación en estadíos más avanzados del desarrollo, ya que se producía una senescencia anticipada con un alto grado de lisis celular en los nódulos de plantas mutantes cuando eran transferidas desde alto co2 a aire. La disminución de los niveles de azúcares y almidón en plantas mutantes en condiciones de aire confirmaban la existencia de alteraciones en el metabolismo carbonado de los nódulos indicativas de una limitación de carbono, particularmente en estas condiciones de fotorrespiración activa. Estudios de hibridación in situ de enzimas claves del metabolismo del carbono en nódulos de plantas mutantes pusieron de manifiesto la modulación por carbono de la expresión de estas enzimas, sugiriendo una mayor funcionalidad en condiciones de menor disponibilidad de carbono, así como una cierta implicación de la gs2 en esta modulación. Otro de los objetivos de este trabajo fue el estudio de los procesos de colonización y desarrollo de micorrizas arbusculares, obteniéndose también efectos de la fotorrespiración y la deficiencia en gs2 sobre este proceso en plantas de lotus japonicus. Por último, se realizaron estudios de fluorescencia de clorofila a y termoluminiscencia que indicaron la existencia de alteraciones en el aparato fotosintético como consecuencia de la deficiencia en gs2, afectando al psii y al potencial asimilatorio de las plantas. Dichas alteraciones debían a su vez guardar relación con la situación de limitación de carbono observada en los mutantes.
Datos académicos de la tesis doctoral «Consecuencias fisiológicas de la deficiencia en glutamina sintetasa plastídica en plantas de lotus japonicus«
- Título de la tesis: Consecuencias fisiológicas de la deficiencia en glutamina sintetasa plastídica en plantas de lotus japonicus
- Autor: Margarita García Calderón
- Universidad: Sevilla
- Fecha de lectura de la tesis: 30/03/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Antonio José Márquez Cabeza
- Tribunal
- Presidente del tribunal: José María Vega piqueres
- eloisa Pajuelo domínguez (vocal)
- Emilio Fernandez reyes (vocal)
- Manuel Becana ausejo (vocal)