Tesis doctoral de Johannes Luis González Guevara
La interacción entre la actividad humana y los diferentes biosistemas no siempre se ha llevado a cabo en un modo sostenible, por un lado debido a un uso indiscriminado de los recursos naturales y por otro producto de una postura egocéntrica en detrimento de los ecosistemas, generando una contaminación ambiental de manera sistemática. En este sentido, en el presente trabajo de tesis se han desarrollado un conjunto de metodologías analíticas basadas en técnicas separativas para el estudio de diferentes tipos de biosistemas donde la acción del hombre ha jugado un papel central, y que servirán en un futuro para profundizar en el conocimiento de esta interacción. Estas metodologías analíticas se implementaron para el estudio de dos biosistemas fundamentales: el reino vegetal como fuente natural de principios activos tanto en el campo terapéutico como nutricional, y por otro lado, en las implicaciones de la contaminación en la salud humana. en un primer estudio se seleccionaron especies de plantas del género erythroxylum, avaladas por la práctica etnomédica, para el establecimiento de metodologías que permitieron la identificación y aislamiento de sus principales agentes antioxidantes y antivirales. En un segundo término se estudió el comportamiento de la quercetina bajo un método de microextracción en fase líquida y su determinación en alimentos vegetales para una posible caracterización como agente antinutricional. en tercer y cuarto lugar se desarrollaron metodologías de microextracción en fase sólida y líquida para el estudio de compuestos orgánicos volátiles de importante toxicidad y sus metabolitos en dientes humanos con vistas a establecer una herramienta analítica futura que permita correlacionar la exposición a estas sustancias y la salud bucal. A continuación se describen los diferentes estudios realizados. caracterización de extractos bioactivos de especies de erythroxylum especies del género erythroxylum que crecen en cuba han sido usadas en la práctica etnomédica para la cura o alivio de diversas enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo y los procesos virales. En este género se han evaluado extractos con actividad antioxidante y antiviral, así como se han identificado familias de metabolitos secundarios predominantes tales como alcaloides, terpenoides y flavonoides. En el presente estudio se desarrollaron metodologías de fraccionamiento guiado por bioensayos para la caracterización química y biológica de las especies seleccionadas. durante la identificación de las familias de metabolitos secundarios presentes en las partes aéreas de seis especies se identificaron predominantemente los polifenoles, en particular flavonoides. Se determinó la actividad antioxidante a través del contenido de fenoles totales y del poder reductor de extractos de etoh de estas especies, así como su actividad antiviral frente a cepas del virus del herpes simple tipo 1 de referencia (hsv-1r) y aislado (hsv-1a). Se realizó el estudio quimiotaxonómico de los flavonoides mayoritarios en cuatro de estas especies mediante cromatografía líquida de alta resolución (hplc), lo que permitió una determinación del patrón de flavonoides característico para estas especies (flavonoides de tipo rutinósido de ombuina y quercetina). Se seleccionó la especie e. Minutifolium por su abundancia, endemismo y mayor actividad biológica de su extracto en etoh (fenoles: 46%, poder reductor: 27,8%, ce50(hsv-1r)=18,14 ¿g/ml, ce50(hsv-1a)=36,88 ¿g/ml). Se caracterizó la fracción menos polar del extracto bioactivo de e. Minutifolium, y se identificaron por hplc-gc-ms ácidos grasos, fitol, ácido benzoico, tocoferol, sitosterol y triterpenos pentacíclicos de tipo lupano y oleanano. Se llevó a cabo posteriormente el fraccionamiento del extracto bioactivo para aislar los metabolitos secundarios mayoritarios y la evaluación de la actividad antioxidante (fenoles totales, poder reductor y capacidad inhibitoria del radical superóxido) y antiviral (hsv-1r y hsv-1a) de las fracciones obtenidas. Mediante el uso de la cromatografía líquida a vacío (dfc) y la cromatografía por exclusión molecular (mec), se aislaron tres glicósidos de flavonol: ombuina-3-o-rutinósido-5-o-glucósido (1), ombuina-3-orutinósido (2) y rutina (3), un triterpenoide tipo oleanano: palmitato de íY-amirina (4), un flavano: catequina (5) y un fitosterol: íY-sitosterol (6), mayoritarios en el extracto. El fraccionamiento y los bioensayos permitieron identificar los polifenoles (fracción de taninos, fracción de glicósidos de flavonoide, rutina y catequina) como responsables de la actividad antioxidante del extracto y a su vez permitió la obtención de la fracción responsable de la actividad antiherpética del extracto total, cuyos responsables de esta actividad podrían ser los triterpenos pentacíclicos identificados. estudio y aplicacion de la microextraccion en fase liquida a la determinacion de polifenoles antinutricionales de la dieta mediterránea. caso de la quercetina en alimentos vegetales la quercetina es una hidroxiflavona predominante en muchas plantas y constituye parte del conjunto de flavonoides que le confieren propiedades antinutricionales a algunos alimentos de origen vegetal. En el presente trabajo se realizó un estudio del comportamiento de la quercetina bajo un sistema de microextracción en fase líquida (lpme) soportada en membrana de tipo hollow fiber para su futura aplicación en la caracterización de esta sustancia como factor antinutricional en alimentos de la dieta mediterránea. Se estudiaron una serie de factores básicos que influyen en la lpme de la quercetina seguido de hplc como sistema de detección y se utilizó el factor de enriquecimiento (ef) como parámetro a seguir. Se emplearon diferentes tipos de membranas líquidas soportadas (slm) como posibles fases orgánicas en el sistema de membranas con el uso de diversos componentes: n-dodecano (dod) como diluyente, dihexiléter (dhe) y n-decanol (dec) como modificadores, y trioctilamina (toa), tributilfosfato (tbp) y cloruro de trioctilamonio (aliquat 336) como transportadores o extractantes. Se utilizaron combinaciones de los distintos componentes de la slm y según las condiciones experimentales se establecieron dos tipos de gradientes: de ph y aniónico. Además, se estimó la influencia del ph de las fases de carga y aceptoras, y también se determinó el paso limitante en cada sistema de gradiente a través del análisis del contenido de quercetina remanente en cada fase después del proceso extractivo. Los resultados obtenidos indicaron una diversidad de situaciones relacionadas con la naturaleza de los componentes de la slm y de las condiciones de las fases de carga y aceptoras. Estos resultados fueron interpretados en términos de estabilidad del complejo analito-transportador y de la interacción entre analito-modificador en la fase orgánica, mostrando efectos negativos y positivos en el transporte. Los sistemas que emplearon dhe+tbp y dod+dec+aliquat como slm bajo gradiente de ph y gradiente aniónico, respectivamente, resultaron ser los más adecuados para la extracción de la quercetina. Sin embargo, los ef mostraron resultados que no superaron el valor de 2, debido por una parte a la estabilización de la molécula en la slm o en la fase de carga. Se realizó un calibrado del método, obteniéndose una linealidad de 0,998, un límite de detección (lod) de 7,3 mg/l y una repetitividad de 1,3%. Se aplicó el método de lpme a tres alimentos utilizados en la dieta mediterránea tales como legumbre (vicia faba), brócoli (brassica oleracea) y té verde (camellia sinensis). Los resultados mostraron una alta capacidad de preconcentración y de clean-up del método aplicado a muestras reales y permitió determinar un contenido de quercetina entre 1,6 y 10,8 mg/g, además de la identificación de otros flavonoides como la catequina y la rutina. determinación de btex y metabolitos en dientes humanos como biomarcadores. Utilización de la microextracción en fase sólida existen diversos grupos de compuestos orgánicos volátiles contaminantes del medio ambiente y perjudiciales para el hombre que provienen de la actividad humana. Dentro de ellos se destacan los btex (benceno, tolueno, etilbenceno y p-xileno) que son absorbidos por el organismo para ser liberados en su forma oxidada como fenoles y ácidos carboxílicos. De las enfermedades que puede ocasionar una exposición prolongada a estos compuestos sobresalen diversos tipos de cáncer. En el presente estudio se establecieron diversas metodologías analíticas basadas en la microextracción en fase sólida (spme) para la caracterización de btex y algunos de sus metabolitos como el fenol (p), p-cresol (pc), ácido mandélico (ma), ácido hipúrico (ha) y ácido 4-metilhipúrico (mha) en muestras de dientes humanos con vistas a establecer un método que permita correlacionar en un futuro el nivel de exposición a estas sustancias tóxicas y la salud bucal. Los métodos de spme consistieron en una simple extracción de los btex y metabolitos con una solución básica extractante a partir del diente, seguido de spme con fibras de polidimetilsiloxano (pdms) y poliacrilato (pa), y posterior análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (gc-ms) o cromatografía líquida de alta resolución (hplc). Se realizó previamente un estudio de optimización de los parámetros cinéticos que rigen el dopaje de los dientes, la extracción con la disolución extractante y la spme con disoluciones dopadas. Los tiempos de dopaje y extracción con naoh 1m fueron optimizados a 4h. los tiempos de adsorción y desorción de la fibra para todos los compuestos estuvieron en el rango de 10-75 min. La validación de los métodos de spme para cada grupo de compuestos: btex, fenoles y ácidos carboxílicos, determinados de forma consecutiva a partir de la misma muestra, mostraron una adecuada linealidad entre 0,984-0,999 en el rango de concentración empleado con una precisión menor del 15%. Los límites de detección (lod) estuvieron en el orden de 0,6-0,9 pg para los btex por spme-gc-ms y 2-333 ng para todos los compuestos por spme-hplc. Los valores de kd fueron superiores a los reportados en la literatura para estos métodos aplicados a esta familia de compuestos. En el análisis de dientes humanos se identificaron btex y fenoles en prácticamente todas las muestras, mostrando un contenido entre 7-1967 ng/g de btex y 36-99 ¿g/g de fenoles. Los ácidos carboxílicos no pudieron ser identificados en estas muestras dentales bajo tratamiento de spme. microextracción en fase líquida mediante membranas liquidas para la determinación de ácidos carboxílicos como metabolitos de btex en dientes humanos los ácidos carboxílicos, productos de la oxidación de los btex después de su absorción por el organismo, constituyen biomarcadores de la exposición a estas sustancias tóxicas. Generalmente se determinan mediante el análisis de fluidos biológicos tales como la sangre y la orina, pero no se han empleado hasta la actualidad otros tipos de muestras biológicas. En el presente estudio se estableció una metodología analítica basada en la microextracción en fase líquida (lpme) soportada en membrana hueca (hollow fiber) para la caracterización de los ácidos carboxílicos ácido mandélico (ma), ácido hipúrico (ha) y ácido 4-metilhipúrico (mha) como metabolitos de los btex en muestras de dientes humanos con el objetivo de establecer un método que permita correlacionar en un futuro el nivel de exposición a estas sustancias tóxicas y la salud bucal. Se desarrolló un método de lpme seguido de hplc con el uso de membranas tipo hollow fiber de polipropileno para el análisis de los ácidos carboxílicos en dientes humanos. Para ello, se realizó un estudio en disoluciones dopadas de los diferentes transportes a través de la membrana líquida soportada (slm): transporte no facilitado con dodecano, dihexiléter y decanol, y transporte facilitado con el uso de los transportadores trioctilamina (toa), óxido de trioctilfosfina (topo), tributilfosfato (tbp) y cloruro de trioctilamonio (aliquat 336). En unos casos se empleó como fuerza de transporte un gradiente de ph y en otros un gradiente de aniones. Se utilizó el factor de enriquecimiento (ef) como parámetro a seguir. Los resultados obtenidos indicaron una variedad de situaciones relacionadas con la naturaleza del transportador y fueron interpretados en términos de estabilidad del complejo analito-transportador formado en la fase orgánica, mostrando efectos negativos y positivos en el transporte. El sistema más simple de decanol como slm sin ningún tipo de transporte facilitado fue seleccionado en este caso, y se optimizaron otros parámetros que afectan los ef, obteniéndose los mejores valores para un tiempo de extracción de 20h, 500 rpm de velocidad de agitado, naoh 1m como fase aceptora y un contenido en sal añadida de 500 mm en las fases de carga. La determinación de algunos parámetros de validación del método de lpme optimizado permitió obtener una linealidad del 0,991-0,999 en el rango de concentración empleado, unos límites de detección (lod) de 0,2-1,6 ng, una repetibilidad del 7,0-10,1 % y una reproducibilidad del 5,3-8,1 %. La aplicación del método de lpme en dientes humanos permitió identificar ma y ha en cantidades entre 2-11 ¿g/g y 0,2-70 ¿g/g, respectivamente.
Datos académicos de la tesis doctoral «Técnicas de separación para el estudio de biosistemas. metabolitos de origen vegetal y contaminantes en tejidos dentales«
- Título de la tesis: Técnicas de separación para el estudio de biosistemas. metabolitos de origen vegetal y contaminantes en tejidos dentales
- Autor: Johannes Luis González Guevara
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 14/12/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Manuel Valiente Malmagro
- Tribunal
- Presidente del tribunal: agustin Garcia asuero
- Carlos Moreno aguilar (vocal)
- (vocal)
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