Tesis doctoral de Ivan Acebron Avalos
Las lectinas son proteínas con capacidad de reconocer carbohidratos que no poseen un origen inmunológico. Forman un grupo amplio de proteínas que se encuentran ampliamente distribuidas en todos los reinos bioló-gicos. Por esta misma razón, las lectinas están involucradas en gran cantidad de procesos esenciales para las células: comunicación celular, señalización, defensa, patogénesis, etc. Aunque las lectinas procedentes de animales y plantas han sido extensamente estudiadas desde un punto de vista estructural y funcional, el reino de los hongos ha atraído la atención estos últimos años debido a que son una fuente de nuevas lectinas con potenciales aplicaciones en biomedicina y biotecnología.En este contexto, recientemente se caracterizó funcional y estructuralmente una nueva lectina del hongo basidiomiceto laetiporus sulphureous. Esta lectina, denominada lsla, consta de dos módulos: un módulo lectina n-terminal (lsl150) y un módulo c-terminal formador de poros (pfm). El módulo lectina exhibe una estructura tipo trébol ¿ formada por la repetición de tres subdominios (¿, ¿ y ¿), constituidos cada uno por cuatro hebras ¿, que generan una estructura globular con pseudosimetría interna de orden tres. La base adquiere la forma de barril ¿, mientras que la copa está formada por un triplete de horquillas ¿ donde reside la capacidad de unir carbohidratos.Una búsqueda racional de lectinas homólogas a lsl150 permitió identificar tres proteínas fúngicas que aún no habían sido caracterizadas: lbl, ssl y anl. La producción recombinante en células de e. Coli de estas proteínas sólo fue satisfactoria en la obtención de los módulos lectina lsl150 y lbl152, que, en definitiva, fueron los que se estudiaron en detalle con el fin de desarrollar aplicaciones biotecnológicas novedosas.La caracterización de estas lectinas ha incluido la resolución estructural mediante cristalografía de rayos x de los complejos con lactosa o n-acetillactosamina, dos ligandos específicos de estas lectinas, así como un profundo análisis biofísico para valorar la estabilidad y la afinidad de estos sistemas. Además, la especificidad de estas lectinas fue estudiada mediante la moderna tecnología de los glycan array masivos, donde se vio que las cadenas de poli-lacnac son el mejor ligando para estas lectinas. La versatilidad de estos dominios para reconocer ligandos multivalentes demostró que pueden unir extractos celulares de organismos invertebrados, lo que puede dar las primeras pistas acerca de su posible función biológica.En el caso particular de lsl150, se realizó un análisis mediante mutagénesis dirigida para encontrar los determinantes que albergan los sitios de unión para reconocer azúcares. De esta forma, conseguimos restituir la funcionalidad en el subdominio ¿ que a priori era incapaz de unir ninguna molécula de ligando. Este estudio permitió tener una visión global del reconocimiento, que demostró ser un evento de elevada complejidad donde no sólo las interacciones entre el ligando y los aminoácidos del sitio de unión juegan un papel clave, sino que el papel del solvente es un elemento crítico que debe ser considerado.Finalmente, toda la información recabada nos dio la oportunidad de desarrollar tres aplicaciones bio-tecnológicas basadas en la utilización de estos dominios como poderosas etiquetas de fusión. En primer lugar, diseñamos un método de expresión y purificación de proteínas recombinantes utilizando cromatografía de afinidad a agarosa. En segundo lugar, empleamos el dominio lectina como una herramienta alternativa para la inmovilización de proteínas de interés industrial. Por último, hemos desarrollado un sistema basado en na-nopartículas magnéticas que sirve para anclar proteínas mediante los módulos lectina reversiblemente y de forma orientada, lo que es una ventaja, por ejemplo, en el diseño de biosensores.
Datos académicos de la tesis doctoral «Búsqueda racional de nuevas etiquetas de fusión: aplicaciones biotecnológicas de los dominios lectina trébol b.«
- Título de la tesis: Búsqueda racional de nuevas etiquetas de fusión: aplicaciones biotecnológicas de los dominios lectina trébol b.
- Autor: Ivan Acebron Avalos
- Universidad: Complutense de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 07/07/2014
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- José Miguel Mancheño Gómez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: José gregorio Gavilanes franco
- margarita Menendez fernandez (vocal)
- Antonio Romero garrido (vocal)
- martín Martínez ripoll (vocal)